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柑橘原生质体融合及体细胞杂种核质遗传研究 摘要 ’ 原生质体融合技术能有效克服柑橘有性杂交不亲和、雌和／或雄性败育以及珠心 ·胚干扰等问题，实现核DNA和胞质DNA重组，为柑橘遗传改良提供了一条新的途 径。本研究旨在针对我国一些优良柑橘品种种子多的问题，拟采用“胞质体．原生质 体”融合和非对称融合，将温州蜜柑控制雄性不育的胞质因子转入有籽品种中，以 获得新的柑橘无核种质。此外，本研究对本实验室以前通过原生质体融合获得的4 个组合的体细胞杂种植株进行了核质遗传分析。主要研究结果如下： 1．开展了柑橘胞质体分离的研究，建立了高效的柑橘胞质体分离体系。首先以 unshiu)的胚性悬浮系为试材分 柑橘胞质雄性不育材料．温州蜜柑国庆1号(Citrus 离原生质体，再通过不连续的甘露醇．蔗糖梯度和超速离心方法分离胞质体；比较了 不同的离心速度、离心时间、离心温度、梯度组分的体积和浓度对胞质体分离的影 min，1 响，结果表明，转速为38000r／min，温度为25℃，离心205％蔗糖浓度(悬 浮原生质体的下层溶液)是分离胞质体最适宜的条件，可获得纯度为90％的胞质体； 胞质体的平均直径为23．2 gm；使用FDA染色，发现胞质体的活力在75．85％之间； 、 h后胞质体破裂死亡。 采用低熔点琼脂糖包埋培养，48 2．开展了柑橘“胞质体．原生质体”融合，获得了国庆l号(C unshiu，CV．Guoqing X reticulata No．1)+诺瓦橘柚(C Cparadisi)、国庆1号(C reticulata +默科特橘橙(C xC．sinens)2个组合的再生愈伤组织和胚状体。前一组 合得到的愈伤组织在诱导胚状体的2％甘油培养基上未见进一步生长和分化；从后一 组合，挑出的44个单个小愈伤培养在2％甘油培养基上，有3个分化出胚状体。对 后一组合再生的三个细胞系进行倍性和核质基因组分析，结果表明，再生的细胞系 均为二倍体，核DNA来自默科特橘橙，而线粒体DNA来源于国庆1号。 3．研究了紫外线(UV)照射柑橘原生质体作为喂养层培养目标原生质体的效果， 发现UV照射的原生质体作饲养层具有促进愈伤原生质体生长的作用，而对叶肉原 生质体的生长无促进作用；研究了UV对柑橘原生质体DNA片段化的影响。结果表 明，UV处理后的原生质体比未处理的原生质体发生较高的DNA片段化。 4．开展了UV处理供体的非对称融合研究，获得了国庆5号(Cunshiu，CV． reticulata No．5)+默科特橘橙(C xC．sinensis)、国庆1号(Cunshiu，CV． Guoqing reticulata×C No．1)+诺瓦橘柚(C unshiu，CV． Guoqing paradise)、国庆l号(C Guoqing 再生的四个芽系进行鉴定，结果表明，再生的芽系为二倍体、三倍体或四倍体的体 1V 细胞杂种，其胞质基因主要来源于锦橙(受体)，其中2个芽系的叶绿体DNA发生 了重组。 质DNA来源进行了鉴定。结果表明，在澳洲指橘+酸橙属间组合中，分析的6棵植 株都是二倍体胞质杂种，其核和胞质DNA分别来自酸橙(叶肉亲本)和澳洲指