美洲商陆抗病毒白缺失型基因pap-lt;,c23gt;在大肠杆菌中的表达及鉴定.pdfVIP

摘 要 美洲商陆抗病毒蛋白(poke、Ⅳced碰诵m 口所g阳口凇)的不同组织或不同生长阶段生成的一类具酶功能的单链核糖体失活蛋白 @bosome血aCtiv撕ng 多种植物和动物病毒。成熟的PAP有262个氨基酸，具有不同的功能区域。现已证明 的主要有2个：一个位于成熟PAP蛋白的N端170．183个氨基酸处，其主要功能是 对病毒产生抗性；另一个位于C．末端1-25个氨基酸处的区域，主要功能与脱去rRNA 的特异位点的腺嘌呤有直接关系，能对寄主产生毒性，而与对病毒抗性无关。获得对 寄主减少或丧失毒性，但不降低或使其提高抗病毒活性的PAP重组蛋白，对其在医药 领域的深入应用研究具有重要的意义。 本文主要工作是通过对PAP蛋白C．末端编码基因的缺失突变，利用原核细胞表 达系统对该突变基因进行高水平表达，并对表达的重组蛋白进行了免疫学鉴定： 1)、本实验从成熟的美洲商陆抗病毒蛋白PAP基因中克隆了C端缺失23个氨基 酸的基因PAP．C23，以PETl01为表达载体构建了重组质粒，转化入大肠杆菌 得表达，表达产物以不溶的包涵体形式存在。通过对表达条件的优化，发现在DTG 终浓度为O．4n尬oVL时，37℃诱导4小时，重组蛋白的表达量最高，可占总包涵体蛋 白的29．6％，获得了高水平的表达。 冲液溶解，再加入等体积的福氏不完全佐剂，乳化完全后，免疫家兔，制备抗PAP b10t 蛋白的多克隆抗体，间接ELISA法测定所制备的抗血清的效价为1：l000。Westem 分析结果显示，该制备的抗血清与表达的n”．c23重组蛋白和天然的PAP蛋白均发生 特异性的免疫反应，表明成功获得PAP蛋白的特异抗血清，同时也进一步证明了 P姐c23基因在大肠杆菌中得到了正确表达，这将为大量生产PAP蛋白以直接应用于 体外防治病毒病害，以及利用对寄主植物无毒的缺失型PAP基因进行抗病毒基因工程 提供目的基因奠定基础。 关键词：PAP蛋白PAP-C23原核表达包涵体抗血清 Abstract ， ． Pokeweed枷V砌proteiIl(n垤)，a29-妨proteiniS0lated舶m尸枷缸cc口 铡口，．fc口刀口，i11Kbits仃ansla：cion a bycatal)rticallyremo、，ingSpecific t0恼 tlle r】卧渔ofthe60ssubu疵of addition la唱e eul【ary0矗c曲osornes．In has ribosome—inaCtiVatillga：bilityPAP m孤lypl锄tS觚d p(她m鲫时VmdactiV毋again_St vimses．Matll陀PAP are硒．T、Ⅳ0fImctional 锄imal h嬲262 a毛丽血(1i保；彻1t劬ctioIlal 玳舔havebeen isme枷Ves沁t11atisin itis proVed．Om for血e a RPbutnot su伍cientfor a血ViI吐a以嘶of necessarily t0)【ic埘． 吣d plant TheotherareaisC-t锄inal25舱ofma：tI】rePAP．b如：mnolocaliza