基因操作的主要技术原理..ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * Maxam-Gilber法所能测定的长充要比Sanger法短一些，它对放射性标记末端 250个核苷酸以内的DNA 序列效果最佳 对于双链DNA片段，由于DNA的两侧均被标记，不能直接用于测序反应。需要经限制性内切酶切割，电泳分离二种不同大小的标记片段，或者直接用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离二条单链，但这种分离方法比较困难，较少使用。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必须先进行一个预杂交的过程。因为能结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。预杂交是将转印后的滤膜置于一个浸泡在水浴摇床的封闭塑料袋中进行，袋中装有预杂交液，使预杂交液不断在膜上流动。预杂交液实际上就是不含探针的杂交液，可以自制或从公司购买，不同的杂交液配方相差较大，杂交温度也不同。但其中主要含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低，不会与DNA探针DNA杂交）、牛血清等，这些大分子可以封闭膜上所有非特异性吸附位点。 预杂交是为了减少探针的非特异性结合。因为在杂交膜上，有的位置结合了待测DNA，但有的位置是没有结合任何DNA的。进行杂交时，带标记的探针有可能与膜非特异性结合，造成假阳性。如果在杂交前用与探针没有互补配对序列的鱼精DNA占据了膜上那些空的位置，杂交时，探针就不能与膜非特异性结合了；当然，由于鱼精DNA与探针没有互补配对序列，探针也不能与鱼精DNA结合。 * * * * * * * * * * * ② dUTP酶缺陷导致细胞内dUTP水平上升，并在DNA复制时，部分取代dTTP进入DNA新生链中。又由于ung缺陷使掺入DNA的dUTP残基不能除去。由这种大肠杆菌菌株产生的M13单链DNA大约有1%的T被U所取代，然后进行DNA定点诱变。 ③ 双链DNA导入正常的大肠杆菌中，其尿嘧啶N-糖基化酶除去DNA链上的尿嘧啶碱基。结果原来的M13模板链被降解，只有突变链因不含U，被保留下来。这种方法产生的M13噬菌体中含有突变DNA的比例大大增加。 2、硫代磷酸诱变法 利用AvaⅠ ， AvaⅡ，BanⅡ，HindⅡ、NciⅠ，PstⅠ，PvuⅠ等酶无法切割硫代磷酸DNA分子的方法建立。 P O OH O OH P O O OH P S OCH2 OH O OH 碱基 硫代核苷酸 将寡核苷酸与M13退火，在具有硫代核苷酸的反应条件下，由DNA聚合酶催化延伸，突变体链是硫代磷酸化的DNA； 连接酶封闭切口； 用NciI切割，只能切割亲本链； 核酸外切酶局部消化 进行聚合反应 三、PCR诱变 1、重组PCR定点诱变 ①设置两个反应管，在每一个反应管中加入两种特定的引物，其中引物A和A’均含有错配核苷酸，但两个引物其他序列与质粒DNA的不同链完全互补，引物B和C均不含有错配核苷酸； ②进行PCR扩增获得含有突变碱基的DNA分子； ④ 将两个反应管中的DNA混合，再经过变性和复性，一个反应管中的一条链和另一个反应管中的互补链杂交，形成两种杂交分子1、2； ⑤ 其中1具有5’端凹陷，不能做为DNA聚合酶的底物，2具有3’端凹陷，做为DNA聚合酶的底物，延伸为完整双链； ⑥ 用B和C做引物进行PCR。 1 2 2、大引物诱变 以第一轮的PCR产物做为第二轮的引物； Taq DNA聚合酶的保真性不高，需要经过测序确定正确性。 第七节 蛋白质与DNA相互作用的研究方法 （一）凝胶阻滞实验（Gel retardation assay），又称DNA迁移率变化试验（DNA mobility shift assay，DMSA） 1、原理 DNA与蛋白质结合后分子量变大，改变了迁移率，由此判断DNA是否与蛋白质发生结合 2、步骤 （1）放射性同位素标记的DNA与蛋白质温育； （2）加样至非变性PAGE，控制条件使DNA与蛋白质保持结合； （3）放射自显影 b a c 3、竞争DNA的作用 反应体系中加入超量的非标记竞争DNA，用于研究DNA与蛋白质作用的专一性 结果a：没有加入竞争DNA 结果b：竞争DNA与探针DNA结合同种蛋白质，竞争DNA是超量的，所以使得探针不能与蛋白结合 结果c：竞争DNA与探针结合不同的蛋白。 （二）DNaseI印迹试验（DNaseI foot printing）