乙脑病毒非结构4A蛋白编码基因重组构建和表达.pdf

一、摘要 中文论著摘要………“ 英文论著摘要………” 二、英文缩略语…………“ 三、论文 —，L．．L 日U舌………………………… 材料与方法…………一 结果…………………” 讨论………………………· 结论………………………………………………………………………………………………………一25 四、本研究创新性的自我评价………………………………………………………26 五、参考文献…………………………………………………………………………27 六、附录 综述………………………………………………………………………………………………………．．29 在校期间科研成绩………………………………………………………………41 致谢………………………………………………………………………………42 个人简介…………………………………………………………………………43 ·中文论著摘要· 乙脑病毒非结构4A蛋白编码基因的构建及表达 目 的 构建乙脑病毒(Japaneseencephalitis hamster 4A蛋白编码基因重组子，将其转染中华仓鼠卵巢(Chineseovary,CHO)细 胞并用间接免疫荧光法探讨该重组子的表达特征，为进一步研究JEVNS4A蛋白 的生物学功能奠定基础。 材料与方法 一、 实验材料 (一)细胞、质粒及菌株 calf 胎牛血清(Fatalserum，FCS)的Dulbecco’modifiedeagle 培养液中；含FLAG片段的JEV NS4A蛋白编码基因重组质粒被命名为pJNS4A NS4A 组质粒构建、转化。 (二)试剂及抗体 No．D31 RNA抽提试剂(Code2)，RT-PCR试剂盒(Code No． 断纯化试剂盒(Takara,productNo．DV807)，DNAA尾试剂盒(诎a地product D404)，琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒(Takara,productNo．DV805)，DNA连接试剂 盒(呲弛product 构建和酶切鉴定。脂质体(Lipofectamine 细胞。氨苄青霉素购自Sigma公司，琼脂糖购自Takara公司，用于质粒的转化和 电泳分析；DMEM高糖培养液，10％FCS，青霉素购白海科隆公司，用于CHO细 Fc(一抗)，购自Cell 胞的培养；兔抗鼠IgG Signaling公司，山羊抗兔(荧光二抗) 购自北京中杉金桥公司，用于质粒转染后的免疫荧光检测。 二、实验方法 (一)厄V NS4A蛋白编码基因重组质粒构建与鉴定 以JEVSAl4—14．2株TotalRNA为模板，运用RT-PCR方法扩增JEVNS4A基 因片段，并在该基因片段的5’端加入FLAG序列，再在其两侧加入起始密码子与 终止密码子，最后在其两侧加入BamHUEcoRI酶切位点。将反转录引物： 5’GAATTCTTAGGCTCCTGCACAAGCT TTC一)合成至JEVNS4A编码基因5’末端。PCR法扩增前向引物 TCC．)合成至 5’末端，反向引物为上述反转录引物。1％琼脂糖凝胶电泳并回收最终PCR产物， 后者与pMDl9．T DNA Gel CTTCATAG3’)为引物进行PCR扩增。将PCR扩增产