嗜水气单胞菌与迟顿爱德华氏菌二联外膜蛋白的表达及其初步免疫原性.pdfVIP

第 34卷 第 1期 华 中 农 业 大 学 学 报 Vo1．34 No．1 2015年 1月 JournalofHuazhongAgriculturalUniversity Jan．2015，96～1O2 嗜水气单胞菌与迟顿爱德华 氏茵二联外膜蛋 白 的表达及其初步免疫原性 王 玉 冯建军 郭松林 林 鹏 集美大学水产学院／鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，厦门361021 摘要 在构建鳗鲡病原性嗜水气单胞菌与爱德华氏菌二联外膜蛋白重组表达载体的基础上，采用不同的诱导剂 (IPTG)浓度、诱导温度、诱导时间和诱导时菌液浓度对重组表达载体的表达条件进行探讨。结果表明，不同诱 导剂(IPTG)浓度、诱导温度 、诱导时间和诱导时菌液浓度对该载体的表达无明显影响。在菌液浓度 D 一 0．8时，采用 0．25mmol／L的 IPTG经 16℃诱导培养过夜后表达。表达产物采用AKTApurifier-100蛋白质纯 化仪，结合 His标签柱亲和层析后获得分子质量87．1ku的高纯度蛋白。蛋白经透析复性后免疫鳗鲡以初步研 究其免疫原性。结果表明，免疫后第28天，重组蛋白不同剂量注射组的鳗鲡血清中抗体效价均显著高于PBS注 射对照组 ，初步表明该重组表达蛋 白具有 良好的免疫原性。 关键词 二联外膜蛋白；嗜水气单细胞菌；迟钝爱德华氏菌；鳗鲡 ；免疫原性 中图分类号 S942．5 文献标识码 A 文章编号 i000—2421(2015)01—0096—07 鳗鲡养殖长期受细菌性疾病的困扰。已发现的 载体的表达条件 ，以选择适宜的表达条件进行该二 鳗鲡细菌性病原有十几种，包括嗜水气单胞菌、兽生 联外膜蛋白的高效表达和纯化，同时采用表达蛋 白 气单胞菌、温和气单胞菌、肫 鼠气单胞菌、威隆气单 背部肌肉注射免疫美洲鳗鲡 (Anguillarostrata)以 胞菌、迟顿爱德华氏菌、致伤弧菌、鳗弧菌和非O1群 初步确定该蛋白的免疫原性，从而为外膜蛋 白基因 霍乱弧菌等_l]。我们近 10年来从发病的养殖鳗鲡 工程二联疫苗的研制奠定基础。 分离到87株病原菌，其中有 61株病原性气单胞菌 1 材料与方法 和 13株迟顿爱德华 氏菌。革兰氏阴性病原菌表面 的外膜蛋 白(outermembraneproteins，OMP)是一 1．1 主要试剂与仪器 种重要的保护性抗原，在宿主体 内具有 良好的免疫 OPD，BSA，SDS，DTT，(3-250，IPTG，弗 氏佐 原性[5]。某些 OMP可对 同属不 同种或 同种不 同 剂 (Sigma)；咪唑 (Amresco)；R-250(TrisGENER 血清型菌株的感染产生交叉保护，从而成为亚单位 AYBIOTECH)；预染蛋 白Marker(Tiangen)；未预 疫苗最具潜力的抗原候选成分之一_l7{]。养殖鳗鲡 染蛋 白Marker(Fermentas)；羊抗兔 IgG (Ther— 长期受气单胞菌和爱德华 氏菌 2个病原菌属的感 oto)；APS(上海生工)；AKTApurifierlO，NiSeph— 染_l9¨，而这 2个病原菌属外膜蛋 白基 因的同源性 arose—Fastflow(GE)；鱼安定(MS-222)；超声破碎仪 很低 ，研制的单种外膜蛋 白亚单位疫苗无法产生交 (Scientz)；冷冻离心机(Sigma)；蛋白电泳装置 (Bio— 叉保护。因此，笔者采用这 2个菌属的代表菌种嗜 rad)；气浴摇床 (Thermo)。 水气单胞菌和迟顿爱德华 氏菌的基因组为模板，分 1-2 质粒、菌株和鳗鲡 别扩增其外膜蛋 白基 因全长 ，选取其表达外膜蛋 白 pGEX-2T-OMP—his重组质粒 ：嵌入质粒 的 目 膜外多肽部分的基因片段进行体外连接后构建了外 的基因序列完整，无颠倒，质粒具有 Amp抗性 。E． 膜蛋 白双基因重组表达载体_1。为进一步获得该 coliBL21(DE3)为高效原核表达工程菌。嗜水气单 表达蛋 白并研究其免疫原性，本研究拟探讨该表达 胞菌(B11)和迟顿爱德华 氏菌 (B79)由集美大学水 收稿 日期