细胞蛋白质纯化..pptVIP

4、等电点 离子交换层析 改变蛋白质混合物溶液中的盐离子强度、pH和（阴、阳）离子交换填料，不同蛋白质对不同的离子交换填料的吸附容量不同，蛋白质因吸附容量不同或不被吸附而分离。 洗脱可采用保持洗脱剂成分一直不变，也可采用改变洗脱剂的盐度或pH的方法洗脱，后一种可分分段洗脱和梯度洗脱。梯度洗脱一般效果好，分辨率高，特别是使用交换容量小，对盐浓度敏感的离子交换剂，多用梯度洗脱。控制洗脱剂的体积（与柱床体体积相比）、盐浓度和pH，样品组分能从离子交换柱上分别洗脱下来。 蛋白分子暴露在外表面的侧链基团的种类和数量不同，故在一定的PH值和离子强度的缓冲液的所带的电荷不同 5、电荷分布 电荷的氨基酸残基可均匀地分布于蛋白质的表面，既可以适当的强度与阳离子交换柱结合也能以适当强度与阴离子结合，因多数蛋白质都有不能在单一的溶剂条件下同时与两种类型的离子交换柱结合，故可得用此性质纯化；电荷的氨基酸残基亦可成簇分布，使某一区域带强正电荷而另一区域带强负电荷，呈强酸性或强碱性，只能在极端pH与阳离子交换树脂或阴离子交换树脂结合，如钙调蛋白只能在pH2时与阳离子交换树脂结合。 6、疏水性 多数疏水性的氨基酸残基藏在蛋白质的内部，但也有一些在表面。蛋白质表面的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分离的能力。 因其廉价和纯化后的蛋白质具有生物活性，是一种通用性的分离和纯化蛋白质的工具。高浓度盐水溶液中蛋白质在柱上保留，在低盐或水溶液中蛋白质从柱上被洗脱，故特别适用于浓硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后的含有目标产品的溶液直接进样到柱上，当然也适用7mol/盐酸胍或8mol/L脲的大肠杆菌的治疗蛋白质提取液直接进样到柱上，在分离的同时也进行了复性。 7、密度 多数蛋白质的密度在1.3~1.4g/cm3之间，分级分离蛋白质时一般不常用此性质，不过对含有大量磷酸盐或脂质的蛋白质与一般蛋白质在密度上明显不同，可用密度梯度法离心与大部分蛋白质分离。 8、基因工程构建的纯化标记 通过改变 cDNA在被表达的蛋白的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的标记可用来作为一个有效的纯化依据。 8、基因工程构建的纯化标记 GST融合载体 使要表达的蛋白质和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和纯化，再利用凝血酶、factor Xa切开或PreScission? Protease。 8、基因工程构建的纯化标记 蛋白A融合载体 使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgG Sepharose纯化。 8、基因工程构建的纯化标记 含组氨酸标记（Histidine-tagged）Chelating Sepharose 最通行的标记之一，是在蛋白质的氨基端加上6~10个组氨酸，在一般或变性条件（如8M尿素）下借助它能与Ni2+螯合柱紧紧结合的能力，用咪唑洗脱，或将pH降至5.9使组氨酸充分质子化，不再与结合Ni2+使之得以纯化。 9、亲和能力 结合效率高，分离速度快的特点。配基可是酶的底物、抑制剂、辅因子、特异性的抗体 吸附后可改变缓冲液的离子强度和PH的方法，洗脱下来，也可用更高浓度的同一配体溶液或亲和力更强的配体溶液洗脱 9、亲和能力 金属螯合介质 过渡金属离子Cu2＋、Zn2＋和Ni2＋等以亚胺络合物的形式键合到固定相上，由于这些金属离子与色氨酸、组氨酸和半胱氨酸之间形成了配价键，从而形成了亚胺金属—蛋白螯合物，使含有这些氨基酸的蛋白被这种金属螯合亲和色谱的固定相吸附。螯合物的稳定性受单个组氨酸和半胱氨酸解离常数所控制，从而亦受流动相的pH和温度的影响，控制条件可以使不同蛋白质相互分离。 9、亲和能力 小配体亲和介质 配体有精氨酸、苯甲酰胺、钙调因子、明胶、肝素和赖氨酸等等。 抗体亲和介质 即免疫亲和层析，配体有protein A和protein G，但protein A比protein G专一， protein G能结合更多不同源的IgG。 外源凝集素亲和介质 配体有刀豆球蛋白、扁豆外源凝集素和麦芽外源凝集素，固相外源凝集素能和数种糖类残基发生可逆反应，适合纯化多糖、糖蛋白。 10、非极性基团之间作用力 溶质分子中的非极性基团与非极性固定相间的相互作用力大小与溶质分子极性基团与流动力相中极性分子在相反方向上相互作用力的差异进行分离。因其流动相中的置换剂是极性小于水的有机溶剂（如甲醇、乙腈、四氢呋喃等），这些有机溶剂可能使许多蛋白质分子产生不可逆的变性；流动相中须有离子对试剂（如三氟乙酸、甲酸、磷酸等）存在才可使分离有效地进行和获得高的质量回收率；分离须在酸性介质中进行（一般pH在2~3