因工程制药工艺创新.pptVIP

生物制药工程 主讲教师： 刘 凯 liukai_1982@163.com 山东农业大学生命科学学院微生物系 第六章 基因工程制药工艺 6.1 基因工程制药微生物表达系统 6.2 基因工程大肠杆菌的构建 6.3 基因工程菌的发酵培养与控制 基因工程技术—基因重组示意图 DNA片段经酶切、连接，形成重组DNA分子 导入宿主细胞系统中扩增 目标基因表达，生成新产物，出现新性状 6.2 基因工程大肠杆菌的构建技术 6.2.1 构建流程 6.2.2 目标基因的克隆 6.2.3 表达载体构建 6.2.4 工程菌构建 6.2.1 工程菌构建流程 6.2.2 目标基因的克隆策略 目标基因：编码蛋白质或多肽的DNA序列 正确克隆的重要性： 只要有一个碱基发生（错义、无义、移码）突变，就导致编码氨基酸的变化，影响产物蛋白质的功能和生物学活性。 只要一个碱基发生同义突变，就可能导致生产过程和效率变化。 基因克隆方法的选择 PCR技术 PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）：由DNA聚合酶催化下，对特定DNA序列进行的复制反应。 本质：生物体的DNA复制原理在体外合成基因。 发明者：Mullis，生物技术革命性象征，1993年获得诺贝尔化学奖。 在引物指导下，以DNA为模板，由DNA聚合酶催化的扩增特定DNA序列聚合延伸形成互补序列的反应。 PCR单反应原理与过程 PCR扩增的反应体系组成 PCR扩增产物电泳 6.2.2 RT-PCR克隆目的基因流程 6.2.2 RT-PCR克隆目的基因流程 1 提取RNA 总RNA提取操作步骤 ： 1、细胞或组织加Trizol后，室温放置5 min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。 2、12,000 rpm 离心5 min，弃沉淀。 3、按200 ?l氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15 min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。 4、4℃ 12,000 g离心15 min。 5、吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱，若只提RNA，则弃下层酚相。 6、按0.5 ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置5~10 min。 7、4℃ 12,000 g离心10 min，弃上清，RNA沉于管底。 8、按1 ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。 9、 4℃ 8,000g离心5 min，尽量弃上清。 10、室温晾干或真空干燥5~10 min。 注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。 11、可用50 ?l H2O，TE buffer溶解RNA样品，55~60℃,5~10min。注：H2O、TE须用DEPC处理并高压。 RNA提取注意事项 严格防止RNA酶污染 1. 佩戴一次性手套 2. 玻璃器皿可以在250℃烘箱中烘烤3小时 3. 枪头、Eppendorf管用0.1%DEPC（搅拌搅匀）水中浸泡。通风橱中室温过夜，扣去液体，高压灭菌30分钟。 DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。 4. DEPC处理的水：0.1%DEPC处理，高压灭菌30分钟脱毒 5. 防止环境中RNA酶污染 2. 转cDNA（防RNA酶） 逆转录: 将mRNA转录成为cDNA 逆转录酶：依赖于RNA 的DNA聚合酶(反转录酶) 禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶 鼠白血病病毒(MLV)反转录酶, 降解RNA DNA杂交体中的RNA 的能力较弱, 对热的稳定性较AMV反转录酶差 cDNA合成: 1. 总RNA 2. 底物，dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP 3. 引物,起始DNA的合成, oligo(dT) 4. 逆转录酶 5. DEPC处理水 温浴 ，按试剂盒说明书。 3. 引物设计 1）长度15~30 bp 2）AT:GC 约50%， 两引物Tm值接近，55~88℃之间。退火温度＝ Tm (4GC＋2AT)－5 3）引物3’末端以G/C结尾较好 4）不形成引物二聚体 5）特异性, 作BLAST搜索 6）简并引物：保守序列；简并度低；具单一密码子 的氨基酸放在3 ’端 7）逆向引物要用互补序列 F：XXXF，5’-? ? ? ? ? ?XXXXXX atggccgcttcgcgtgcaacg-3’ atggccgctt