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实时荧光定量 PCR 方法简介 一． 实时荧光定量 PCR 的基本原理 理论上，PCR 过程是按照2n （n 代表PCR 循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但 在实际的PCR 反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗 （主要是由于聚合酶 活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在 起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法 （利用 EB 染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB 染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。 为了能准确判断样品中某基因转录产物 （mRNA ）的起始拷贝数，实时荧光定量 PCR 采 用新的参数——Ct 值，定量的根本原理是Ct 值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反 比关系。 Ct 值是如何得到的 在实时荧光定量PCR 的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR 仪 全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而 得到每个样品的Ct 值。 Ct 值的定义 Ct 值中的 “C ”代表 Cycle （循环），“t ”代表检测threshhold （阈值），其含义是PCR 扩 增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对 应的横坐标。 Ct 值与样品中模板的对应关系 Ct 值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x 代表起始模板拷贝数 的对数，y 代表Ct 值）。 与终点法相比利用 Ct 值的优势 由于Ct 值是反映实际PCR 反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂 消耗等因素的影响，因此利用Ct 值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统 的终点检测法是在PCR 扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB 等染料染色来判断扩 增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。 下图中是 96 个复孔的实时扩增曲线 （完全相同的反应体系、相同的反应 protocol 、相同 的样品起始浓度），可以看到Ct 值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300 个单位。 此外，采用实时荧光定量PCR 还能从方法学上有效的防止PCR 实验中交叉污染的问题。 因为荧光定量PCR 中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果， 直接丢弃含有大量扩增产物的反应管，彻底避免了传统方法中取出扩增产物进行电泳鉴定时 扩增产物对实验室造成二次污染的可能性。 二． 荧光定量 PCR 的 2 类方法 （按荧光产生的原理分类） 染料法 （SYBR Green 法） 染料法即利用 SYBR Green 分子产生的荧光信号来进行样品定量。该方法与常规的PCR 类似，唯一的区别是在反应体系中加入了SYBR Green 染料分子。该染料分子的激发波长为 497nm，发射波长为520nm。与EB 的性能类似，SYBR Green 也是一种扁平状的分子，处 于游离状态时具有很低的荧光本底，当反应体系中存在dsDNA 时， SYBR Green 能特异性 的与之结合并在497nm 激发下。 染料法的优点：1，无需设计、合成探针，实验成本低；2 ，使用方便，与常规PCR 的操 作几乎相同。 染料法的缺点：1，由于SYBR Green 与dsDNA 的结合只具有结构特异性而不具有序列特 异性，除了与特异性的靶序列扩增产物结合外，还能与在PCR 扩增过程中形成的引物二聚 体、非特异性扩增产物结合，从而造成扩增效率的降低、结果的不准确。因此采用该方法对 于引物的设计及实验条件的优化要求很高，确保反应过程中没有非特异性产物的扩增；2