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RealtimePCR检测桦树皮提取物对HMVEC细胞VEGFmRNA表达的影响 刘淑静，陈芝芳，李岩 (北京理工大学药理学教研室，北京，100081) 摘要:目的：应用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测桦树皮提取物（HSP）作用人微血管内皮细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA的表达。方法：体外培养人微血管内皮细胞HMVEC，应用不同浓度桦树皮提取物(75ｕg.ml-1和150ｕg.ml-1)分别处理24h和48h，采用SYBR Green I荧光实时定量RT-PCR法检测,以β-actin基因作为内参,计算各组VEGFmRNA的相对表达量。结果：HSP75ｕg.ml-1、150ｕg.ml-1浓度组作用48小时,VEGFmRNA的表达量明显降低，HSP75ｕg.ml-1、150ｕg.ml-1浓度组作用48小时能明显抑制HMVEC细胞内VEGFmRNA的表达。结论：桦树皮提取物通过抑制VEGFmRNA的表达从而达到影响肿瘤新生血管的形成。 关键词:桦树皮提取物;血管内皮生长因子;荧光实时定量RT-PCR 桦树皮为桦木科, 植物白桦的外皮。民间早已用于清热解毒、止咳平喘、降脂、利胆等。桦树皮提取物化学成分复杂，包括三萜类物质（包括白桦脂醇、桦木酸、羽扇豆醇、白桦烯三醇）、各种高级脂肪酸、氨基酸、糅质、酚性物质、还原性物质、多糖类、各种微量元素等。而三萜类物质中研究较多的就是白桦酸和2,3-羟基桦木酸。它是一种广泛存在于自然界的五环三萜类化合物，并证明了它具有广泛的生物学活性：抗肿瘤、抗病毒、抗细菌、抗寄生虫及免疫调节作用等，本研究表明桦树皮提取物能够抑制血管内皮生长因子的基因水平的表达从而达到抑制肿瘤新生血管的生成，达到抗肿瘤的作用。 1　材料 1.1　主要试剂　新生牛血清(NBS)购于杭州四季青生物工程材料有限公司,桦树皮提取物（HSP）,实验室自提，RP2MI1640培养基干粉购于Gibco公司 ,RNAiso Reagent及SYBR(PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Perfect RealTime)购于Fermentas公司。 1.2 主要仪器　ABI PRISM 7700 Sequence Detector real-time PCR仪,Tanon3500凝胶成像系统,德国SIGMA 1-15PK型高速冷冻离心机,美国NanoDrop技术公司ND-1000 spectrophotometer核酸测定仪。 1.3　细胞　人微血管内皮细胞（HMVEC）培养于25cm2培养瓶中，培养基为RP2MI1640，其中添加了10%的胎牛血清、100μg.mL-1青霉素G和100μg.mL-1链霉素。每瓶加培养基5mL，培养于含5%CO2、饱和湿度的37℃恒温培养箱中，每天换液，2~3天传代。 1.4 引物设计　引物合成及序列VEGF及β-actin上下游引物由上海生工生物公司设计合成。VEGF上游引物: 5′-GAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTC-3′,下游引物: 5′-CGATCGTTCTGTATCAGTCTTTCC -3′;β-actin上游引物: 5′-CGCTGC GCTGGTCGTCGACA-3′,下游引物:5′-GTAACGCACGATTT CCCGCT -3′。 2　方法 2.1 HSP处理HMVEC细胞　HMVEC细胞贴壁长至单层90% ~95%时胰酶消化,以含10% NBS的RP2MI1640调整细胞密度为1×106·L-1接种于直径60 mm无菌培养皿, 37℃、5% CO2饱和湿度下培养,细胞长至70% ~80%时用不同浓度桦树皮提取物(75ｕg.ml-1和150ｕg.ml-1)分别处理24h和48h，DMSO阴性对照。 2. 2　RNA提取及逆转录反应　用RNAiso Reagent试剂参照说明书操作步骤提取处理好的HMVEC细胞总RNA,核酸测定仪测A260/A280,要求在1·8~2·0之间,同时1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量。逆转录反应:每20μl逆转录体系中加入上述总RNA 200 ng作为模板进行反应,逆转录条件: 42 ℃保温60分钟,95℃ 5分钟，4℃ 1-5分钟，可迅速放入-20℃长期冻存。 2.3　标准曲线制备　稀释cDNA成4个梯度(100、10-1、10-2、10-3),分别进行靶基因VEGF及内参基因β-actin的SYBR Green I实时定量PCR反应,制备两基因的标准曲线并检测扩增效率。 2. 4　SYBR荧光实时定量PCR　设定PCR程序: ⅰ. 94℃预变性 2min；ⅱ. 94℃变性，30sec；ⅲ. 63℃退火，30sec；ⅳ. 72℃延伸，30sec,重复