酸性多糖甲基化分析方法的改进.pdf

万方数据 万方数据 酸性多糖甲基化分析方法的改进 摘 要 酸性多糖中羧基和硫酸根等酸性基团的存在，影响了其在甲基化溶剂中的溶 解，致使甲基化程度往往较低，且糖醛酸中羧基的存在导致酸性多糖不易气化和 水解，限制了其应用气相-质谱连用（GC - MS ）进行结构分析，制约了甲基化方 法在酸性多糖中的应用。本文对甲基化分析过程中出现的酸性多糖不易在甲基化 试剂中溶解和硫酸根位置不易确定等问题进行了研究，以含有糖醛酸和硫酸根的 酸性多糖标准品硫酸软骨素（CS ）为原料，对含有糖醛酸的酸性多糖还原的条 件进行优化，确定最佳的糖醛酸还原条件；对含有硫酸根的酸性多糖的脱硫方法 和其在甲基化试剂中的溶解性等问题进行了探讨，对比研究确定最佳的酸性多糖 甲基化条件，为酸性多糖的结构分析奠定基础。 首先以 CS 为研究对象，对糖醛酸羧基还原的方法进行改良。比较了钠型 和氢型 CS 样品分别在不同缓冲液体系、控制pH 值的条件下，还原率的高低。 结果显示，氢型 CS 在改良后的75% 四氢呋喃 - 0.1 mol/L 2 - 吗啉乙磺酸（THF - MES ）的缓冲液中，pH 4.75 和 50 ℃ 的条件下，采用碳二亚胺-硼氢化钠（EDC - NaBH ）法还原，糖醛酸还原率高达98% 以上，明显高于钠型。比较了不同检 4 测方法测定糖醛酸还原率的优劣，结果显示高效液相色谱（HPLC ）法快捷方便， 结果准确，是一种理想的糖醛酸还原率检测方法。将该方法应用于不同结构的酸 性多糖糖醛酸还原中，表明该方法具有普适性，不仅适用于 CS 类，同样适应 于透明质酸 （Hyaluronic Acid ）和肝素 （Heparin ）中糖醛酸还原，也适用于海洋 来源的聚甘露糖醛酸（Polymannuronic Acid ）及褐藻糖胶（Fucoidan ）中糖醛酸 的还原，为不同酸性多糖结构分析，尤其甲基化分析中确定多糖连接方式提供了 前提。 对酸性多糖甲基化分析中样品溶解性差和脱硫不完全等问题进行探讨。通过 将含硫酸根的 CS 与不同碱成盐进行甲基化，发现将 CS 与三乙胺成盐能极大 提高其在甲基化试剂中的溶解、提高甲基化产率，全甲基化产率可达40% 。通过 比较 CS 通过 PMA 法和甲醇 - DMSO 法进行脱硫，发现采用 PMA 法脱硫后 万方数据 硫酸根含量低、分子降解程度较低，是一种比较理想的脱硫方法。通过将 CS 及 其他酸性多糖经过糖醛酸还原和 PMA 脱硫以后，GC - MS 结果显示样品离子 响应明显提高，说明此方法适于含有糖醛酸和硫酸根酸性基团的酸性多糖甲基 化，利于进一步的结构研究。且首次发现多硫酸根样品甲基化后全甲基化样品会 较多溶于水层，对水层与氯仿层样品同时进行 GC - MS 对比分析，可得到较准 确的结构信息。 本文利用所建立的方法，通过对不同结构的含有糖醛酸的酸性多糖进行了验 证，表明改良的糖醛酸还原法是一种理想的还原方法，为各种来源酸性多糖中糖 醛酸的还原以及酸性多糖的结构分析提供了有用参考；对甲基化分析中问题进行 探讨优化，解决了含有糖醛酸部分发生 β - 消除影响结构的测定，硫酸基团影响 酸性多糖溶解性等问题，为酸性多糖甲基化后续研究奠定了基础，为从事酸性多 糖构效关系研究以及海洋糖类药物开发提供了基础。 关键词：酸性多糖；糖醛酸；还原；硫酸基团；甲基化；硫酸软骨素；