16S_rDNA鉴定细菌的方法.docVIP

16S rDNA鉴定细菌的方法 细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分： 1.提取细菌基因组DNA,2.引物进行PCR扩增，3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。6.BLAST比对获取相似片段。7.构建系统进化树 培养基 1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高1，pH大约下降0.03个单位。0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA?2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HCl（pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。高温高压灭菌，室温保存。 1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。10%SDS（W/V）：称10g，68加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65溶解。配置时要戴口罩。6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4保存。7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在65溶解。8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓储存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4保存。12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。13、EB：10 mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。EB的工作浓度为0.5ug/ml。当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56。无需预处理。15、RNase A：10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水2460 ul，于100加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20。 材料准备 破碎细胞或胞膜—内容物释放 核酸分离、纯化 沉淀或吸附核酸，并去除杂质 核酸溶解在适量缓冲液或水中 基因组DNA提取所需仪器：高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪 细菌基因组DNA提取方法综述 细菌基因组DNA的提取方法主要有5种。不同的方法所选择的试剂会有所不同。 1 快速微量提取法 取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。 加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。 然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。 取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。 加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。 2 蛋白酶/SDS法制备 用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp. 4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次。 将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h-5h。 用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一