副溶血弧菌tdh基因LAMP检测技术建立.pdfVIP

第12卷第8期 中国食品学报 V01．12No．8 2 0 1 2年8月 JoumalofChineseInstituteofFbodScienceand 01 2 Techn0109y Aug．2 副溶血弧茵姗基因LAMP检测技术的建立 程晓艳1，2刘庆慧P黄健1 (1农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室 中国水产科学院黄海水产研究所 山东青岛26607l z中国海洋大学食品科学与工程学院 山东青岛266003) 摘要 isothe瑚al 环等温扩增技术(Loop—mediatedamplification，LAMP)是一种在等温条件下高特异性、高效、 快速地扩增靶基因的DNA扩增技术。根据副溶血弧菌特异性的毒力基因￡砒保守序列．本文设计1套特异性引 物对该基因进行环等温扩增，同时对反应条件进行优化．建立携带t砒基因的致病性副溶血弧茵的LAMP快速 检测技术。结果表明，IAMP最适反应在60．8℃恒温、45min内完成，与其它常见的细菌无交叉反应。LAMP方法 的细菌DNA最低检出限为35．5纠反应管，灵敏度较PCR方法高10倍。对扇贝样品中分离的菌株的检测表 明，LAMP方法对检测致病性副溶血弧茵具有良好的可靠性。 关键词 副溶血弧菌；环介导等温核酸扩增；耐热直接溶血毒素基因(f砒)；快速检测 文章编号1009—7848(2012)08一0156—07 副溶血弧菌(y沾一op甜砒∞，加Zicw，VP)广出现，使许多研究者应用该技术检测各种病原微 泛分布在世界各地的沿海地区．是一种常见的食 生物【5川。LAMP主要依赖一种具有链置换活性的 源性致病菌．主要污染海产品．尤其是贝类。近年 DNA聚合酶．识别6～8个区域的4～6条引物，在 来，在我国由副溶血弧菌引起的食物中毒高居细 等温条件下(约60～65℃)快速、特异地扩增靶基 菌性食物中毒的首位，特别是沿海省份。大部分环 因：扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的 境分离株及海产品中的副溶血弧菌是非致病菌。 茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA混合物，电 致病菌株主要是产生耐热直接溶血毒素TDH(由泳后在凝胶上形成梯子形条带嗍。可以直接通过 肉眼观测反应产物中是否形成白色沉淀(混浊)来 ￡砒基因编码)，它是一种细胞毒素，在Wagatsuma 血琼脂平板上产生神奈川现象(Kanagawaphe— 判断靶序列扩增与否【10】。本文针对副溶血弧菌耐 direct nomenon，KP)，￡如被认为是副溶血弧菌最主要的热直接溶血毒素基因“he珊ostablehaemolvsin， 毒力基因【11。超过95％的副溶血弧菌临床分离菌株t如)设计LAMP特异性引物．期望建立一种快速 带有斑^【2]。目前常用的检测方法有生化鉴定、 检测致病性副溶血弧菌技术。 PCR、实时定量PCR等[删。生化鉴定工作量大，需 要至少3d的时间。PCR和实时定量PCR等现代 检测技术虽然可以满足快速的检测要求，但需要 1材料与方法 专业技术人员，昂贵的试剂和检测设备。这限制了 1．1 试验材料 其广泛应用。随着现代生命科学技术的发展．一种 副溶血弧菌(y站riDp嘶砒∞，聊坼ic黜， 新的核酸扩增技术——环介导等温核酸扩增(Loop— mediatedisothe瑚al amplification，简称L～MP)的 弧菌(y曲一。吼班泖甜M，n)、灿烂弧菌(y沾一osPfen． 收稿日期：2011—08—20 ‘ (y站r幻^伽