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荧光定量PCR技术原理 罗氏诊断产品（上海）有限公司 主要内容 • 荧光定量PCR与普通PCR的区别 • 荧光定量PCR仪器的选 • 绝对定量和相对定量原理 2 PCR原理 3 实时荧光定量PCR技术 典型PCR扩增曲线 • 在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随 着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强 度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信 ，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从 而得到一条荧光扩增曲线 4 Ct值与起始模板的关系 N=N ×E n ，logN=log N +nlogE n=Ct 0 0 Ct值与起始模板的关系研究表明： 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。 起始拷贝数越多，要达到域值所需得循环数越少，即Ct值越小。 5 两者区别 普通PCR 荧光定量PCR 在PCR反应的平台期检测， 在PCR反应的对数期检测， 分析终点产物的量 分析起始点产物的量 检测模式为电泳 实时监测荧光信号 0 10 动力学范围有限 动力学范围广(10 ～10 拷贝/mL ) 副产物形成不能鉴别 有效鉴别非特异扩增和突变 绝对和相对定量困难(相对于 不仅可以相对定量， 看家基因的定量复杂) 还可以绝对定量 主要内容 • 荧光定量PCR与普通PCR的区别 • 荧光定量PCR仪器的选 • 绝对定量和相对定量原理 7 罗氏诊断与PCR技术的渊源 • 1985 Kary Mullis 发明了PCR技术 • 1991 Roche公司获得全球PCR专利权 • 1993 Roche公司的科学家Russell Higuchi发明全球第一台实时定 量PCR仪 • 1993 Kary Mullis 因发明PCR技术而获得诺贝尔化学奖 • 1995 Roche公司推出COBAS Amplicor™病毒载量分析仪，目前是 诊断行业PCR定量的金标准，唯一获得美国FDA认证的定量PCR仪 • 2001 Roche公司获得Real-time PCR专利和TaqMan技术专利 • 2007 基因扫描分析功能整合至qPCR平台，科学研究领域大大扩展