乳腺癌病人组织血液中microrna的表达：一种潜在的乳腺癌筛选标记.pdf

摘要 中文摘要 论文题目： 乳腺癌病人组织和血液中microRNA的表达：一种潜在的乳腺癌筛 选标记 博士研究生： 吴倩 导师姓名： 陆祖宏教授 学校名称： 东南大学 早期乳腺癌患者通常缺乏明显的临床体征，而且目前临床上尚无有效的早期 辅助诊断方法，多数病例在确诊时已是中晚期，治疗效果不佳，预后较差。因此 寻找乳腺癌的前期发病标志，对于乳腺癌的早期诊治及实施一级预防具有重大意 标志。而在血液中检出癌症特异性的miRNA并将其作为癌症的生物学标志对于 早期诊断癌症则具有至关重要的意义。目前获得miRNA表达谱的方法有小RNA 克隆、Northern印迹、芯片技术、定量实时PCR技术及深测序研究方法，其中 测序方法能轻易的解决芯片技术在检测小分子时遇到的技术难题(短序列，高度 同源)，而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量测序的长度，使得数据“不 浪费”，同时测序方法还能在实验中发现新的小分子RNA。所以本论文采用ABI 公司的SOLID测序仪对乳腺癌病人肿瘤组织和血清miRNA谱进行测序分析，发 现差异表达的miRNA，同时发现新的miRNA。本论文分为三部分： 第一部分 首先，分别建立肿瘤组织和血清miRNA表达谱：收集未经放疗和化疗的原 发性乳腺癌组织及癌旁组织各5例；收集未经放疗和化疗的原发性乳腺癌病人血 液13份，年龄匹配健康人血液10份。获得下列miIⅢA表达谱：(1)乳腺癌组织； (2)癌旁组织；(3)乳腺癌病人血清；(4)对照血清。建立两套不同的miRNA表达谱： 乳腺癌组织VS．癌旁组织，乳腺癌血清VS．对照血清，进行比较。我们找出在肿瘤 组织和血清均上调表达的miRNA进一步筛选和验证。 miR．24and miR．25)在乳腺肿瘤组织和乳腺癌病人血清中都发生上调改变。 同时挖掘测序数据，利用生物信息学分析发现一新的miRNA：miR．BSl。 东南大学博士论文 第二部分 对候选miRNA进行两轮筛选，首先在小样本中(20份未经放疗和化疗的原 发性乳腺癌病人肿瘤组织和癌旁组织)，检测7个miRNA的表达情况，发现 和化疗的原发性乳腺癌病人(50例)、乳腺良性肿瘤病人(乳腺纤维瘤、乳腺囊 性增生病、乳腺大导管乳头状瘤、脂肪瘤，20例)，卵巢癌病人(20例)和正常 对照(50例)血清)验证其灵敏度和特异性。结果发现miR-222在乳腺癌病人 operative to0．7775)。以0．006为截断点 健康人(曲线下面积为0．6712，95％CI=O．5649 to9．971)。 ratio)为4．269(95％CI=1．828 瘤样本中miR．2220．006的OR值(odds 而且miR-222在乳腺肿瘤病人，健康对照，乳腺良性肿瘤病人和卵巢癌病人血清 中表达有明显差异(P-o．006)，提示miR-222可能是潜在的乳腺肿瘤筛选标志物。 第三部分 针对前期测序结果利用生物信息学分析发现一新型miRNA，命名为miR-BSl， 从二级结构，系统保守性，表达，生物功能，靶基因预测分析等方面综合验证其 真实性。1)miR-BSl前体二级结构符合茎环结构，同时是处在具发夹结构的前 序列发现在小鼠(Mus musculus)，果蝇(Drosophila norvegicus)，非洲爪蛙(Xenopus anub捃)和大西洋鲑(Salmosalar)中各有一条miR-BSl序列，将不 狒狒(Papio 同物种miR-BSl成熟序列进行多序列比对分析，发现为第5位到第1iS以及第13 位到第17位碱基为保守碱基，说明miR-BSl基因在不同物种间的高度保守性。将 具有相同的种子序列， (ACUGUAGUAUGGGCACUUCCAG) Blot方法证明miR-BS1 (GCAGUCC△型鱼QQ￡△始UACAC)。3)采用N