嵌合型乙肝病毒心蛋白病毒样颗粒的原核表达及初步应用.pdfVIP

摘要 摘要 virus B，HBV)，具有高效人肝细胞靶向性，为乙肝病 乙肝病毒(Hepatitis 毒样颗粒成为基因载体提供了一定的靶向基础。作为乙肝病毒结构蛋白之一的核 心蛋白(HBcAg)可以自组装形成正二十面体并具有良好的解聚／自组装功能， 其C末端的富集正电荷序列可以通过静电吸引力与核酸相互作用，为基因载体 提供了新的选择。本文利用基因工程方法构建，并通过原核表达系统诱导表达几 VLPs)，对其理化性质及基因载 种不同的以HBcAg为基础的病毒样颗粒(HBc 体应用进行初步研究。主要研究如下： (1) 序列并结合大肠杆菌偏好密码予偏好性进行密码子优化后，全基因合成获得 和HBc．preSl的第129．130个氨基酸之间插入带有自由氨基的赖氨酸。 (2)将获得的目的片段连接至原核表达载体pET43．1a上，以大肠杆菌BL21 (DE3)作为宿主进行诱导表达。通过硫酸铵沉淀、DEAE离子交换色谱和 CL 4B琼脂糖凝胶分子筛对7种病毒样颗粒进行纯化，得到了90％以 Sepharose 上纯度的病毒样颗粒。 (3)利用透射电镜(TEM)、Westernblot等方法对病毒样颗粒理化性质进 行鉴定得到了有明显病毒颗粒状的7种蛋白。另外，考察了HBe一144、HBc．144．Tat、 I-IBc．183三种病毒样颗粒在尿素作用下的解聚与自组装效果。利用荧光光谱仪测 定了I-IBc．144、HBc．144一Tat和HBc．1 83对荧光素酶质粒pGL3的包封能力。最 终得出HBc．183对基因的包裹能力最强，包封率可达到90．78±1．79％。 (4)VLPs的基因运输能力通过流式细胞仪和化学发光仪测定。7种HBc VLPs均具有高效的细胞内吞作用，在1h内即可达到99％以上细胞内吞率。通 过研究HBc 白表达来考察HBcVLPs作为基因载体的能力。 关键词：基因载体；HBcVLPs：原核表达：细胞转染 Abstract Abstract BVirus(HBV)infects andcausesacuteand Hepatitis hepatocytesspecifically in chronicfiverdiseaseshuman．AsOneofthes1胍嘶l in BVires proteinsHepatitis core intoaicosahedral (HBV)particles，theprotein(HBcAg)assemblescapsid． ofthree Because existintheCterminalof SPRRR(Ser-Pro-Ar争A唱一arg)motifs Caninteractwith with electrostaticattraction． HBcAg，it genesnegativechargethrough VLPsmakesanewchoicefor vectors．Inthis virus Therefore，HBc gene paper,seven like basedOil areconstructedand