（第五章）蛋白质分析技术.ppt.pptVIP

2．空气流动蒸发浓缩： 空气的流动可使液体加速蒸发。如将样品溶液装入透析袋置于冷室，用电扇对准吹风，使溶剂不断蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。 3．冰冻法： 将待浓缩样品放在低温结成冰 （盐类及生物大分子不易结冰内而留在液相中），然后缓慢地溶解，利用溶剂与溶质熔点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。例如：蛋白质的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质的冰结晶浮于液面，蛋白质集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质的浓缩液。 4．吸收法： 通过吸收剂直接吸收除去溶液使之浓缩。所用的吸收剂必须与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇、聚乙烯吡络酮、蔗糖和凝胶等。使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇覆盖置于4℃下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的浓缩程度。 5．超滤法： 液体在一定压力(氮气压或真空泵压)下通过超滤膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻而保留。该法适于蛋白质和酶的浓缩或脱盐，它具有成本低、操作方便、条件温和、能较好地保持生物大分子的活性、回收率高等优点。 应用超滤法要注意膜的选择，不同类型和规格的膜水的流速、分子量截止值等参数均不同，必须根据实际需要来选用。 超滤装置形式、溶质成分及性质、溶液浓度等对超滤的效果有一定影响。如用超滤膜制成的纤维管超滤透析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短了10倍。 * * * 蛋白质分析技术是用来分析蛋白质的含量、纯度、氨基酸组成和结构的技术。 常规的蛋白分析技术包括蛋白质的分离纯化、蛋白质含量测定、蛋白质理化性质等方面。 第五章 蛋白质分析技术 王 英 第一节 蛋白质的分离纯化 研究蛋白质，首先要得到高纯度并具有生物活性的蛋白质标本。 蛋白质在组织细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，在生物样品中除含有目的蛋白质外，还含有其他蛋白质、多糖、脂类和核酸等混杂物质。 一、蛋白质分离纯化的目的： 要研究或制备某种蛋白制剂必须进行分离纯化。 能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质，是因为不同蛋白质的理化和生物学性质有着极大的不同，这些差异主要是组成蛋白质的氨基酸序列和数目不同，使不同多肽链的分子量、带电状况、亲水性等存在差异，同时不同多肽链所折叠成的二级结构、三级结构和四级结构也存在差异，利用待分离的蛋白质与其他蛋白质之间存在的这些差异，即能设计出一个合理的分离方案。 二、分离纯化的理论基础： 根据蛋白质的种类、性质、所处体系以及分离纯化的目的不同，分离纯化的步骤也不相同，但是多数分离纯化工作中都有相类似步骤与手段，如下图所示。 三、分离纯化的主要步骤： 四、分离纯化的操作步骤 （一）选择材料和预处理 选择材料要依据试验目的及遵循以下原则： ① 选择有效成分含量高的新鲜材料； ② 材料来源丰富易得； ③ 获取工艺简单易行； ④ 成本比较低。 目标蛋白质含量受到原料的种属、季节、发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品宿主菌或细胞的培养条件的影响。 材料选定后，通常进行预处理： 将不必要的结缔组织、脂肪组织等在尽可能接近生命状态下剔除，处理后应立即使用或在冷库中保存。 制备某些在体内易被分解的活性蛋白质、酶类或蛋白激素时，必须选用新鲜材料。 （二）细胞的破碎 对于组织细胞内各种蛋白质的分离纯化都需事先将组织细胞破碎，使蛋白质充分释放出来。 不同的生物体或不同的组织，细胞破碎难易不一，使用的方法也不尽相同。 胰脏、肝脏、脑组织一般比较柔软，用普通的匀浆器研磨即可； 肌肉、心脏组织较韧，需预先剪碎再作匀浆； 许多微生物都有坚韧的细胞壁，需用自镕、冷热交替、加砂研磨、超声波和加压处理等方法。 目前已建立了多种破碎细胞的方法，根据作用方式的不同可分为机械法、物理法、化学法三大类。 1、机械法 通过机械切力的作用使组织细胞破碎的方法称为机械法，如匀浆、研磨等。 （1）匀浆：匀浆是破碎软组织最常用的方法。其原理是利用匀浆器剪切力破坏组织和细胞，释放蛋白质进入溶液。 匀浆器有四大类，刀片式组织破碎匀浆器、内切式组织匀浆器、玻璃匀浆器及用于规模生产的高压匀浆器。 （2）高速组织捣碎： 此法适用于动