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第十四章 基因重组与基因工程 孙凌云 二、位点特异重组 λ噬菌体DNA的整合 细菌的特异位点重组 免疫球蛋白基因的重排 三、转座重组 （一）插入序列转座 （ insertion sequence） 四、细菌的基因转移与重组 （一）接合作用 (conjugation) 重组体如系大肠杆菌质粒，可在0-4℃用CaCl2处理大肠杆菌，以增大其细胞膜的通透性，再将CaCl2处理过的受体细菌与重组质粒温育；使质粒透人菌体，将重组DNA导人宿主细胞以改变其某些特性，此过程称为转化（Transformation ）作用。 重组体如系噬菌体DNA，可进行体外包装，将其包人入噬菌体的头部外壳蛋白，并使其含有尾部蛋白，成为有侵染力的噬菌体，以导人宿主细胞。亦可用CaCl2处理宿主细胞，将重组DNA直接引入细胞，以供体DNA通过噬菌体导人细胞引起的转化作用称为转导（ Transduction）。 重组DNA进入真核宿主细胞，则称为转染（Transfection ）。 3、多聚核苷酸激酶 5’-HO OH-5’ 5’-P P-5’ ATP 4、末端转移酶 3’ 5’ NNNNNNN 5’ dNTP 5’ 3’ 5’ NNNNNNN 5、碱性磷酸酶 5’-P P-5’ 5’-HO OH-5’ （三）目的基因（ target DNA） cDNA gDNA （四）基因载体（ vector） 1、概念 (concept) 2、种类 (types) bacterial plasmid DNA，质粒 cosmid DNA，粘粒 phage DNA，噬菌体 viral DNA, 病毒 yeast artificial chromosome， 酵母人工染色体 克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 3、分类 3、结构特点 (features of structure) 复制起始点(origin of replication) 单一的限制酶切割位点(cloning site) 选择标记(selection marker) 三个基本要素 二、重组DNA技术的基本流程 获得目的基因　　　　选择/构建载体 重组DNA分子 导入受体细胞 筛选转化细胞 外源基因表达 一、 目的基因的获取 1、化学合成 2、基因组DNA (genomic DNA library) 3、cDNA (cDNA library)4、聚合酶链反应（PCR） 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 * 从基因组DNA文库获取目的基因 目 录 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 * 从cDNA文库获取目的基因 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T 目 录 K B Mullis M Smith Shared the Nobel Prize in Chemistry 1993. PCR技术基本原理 （二）载体的选择与构建 载体的功能：携带外源DNA进入宿主细胞， 并使之在宿主细胞中繁殖 载体的选择: 宿主细胞类型 插入片段大小 克隆or表达 （三）载体与目的基因的连接 1、粘性末端连接 （1）同一限制酶切割产生的粘性末端 限制酶；DNA连接酶 （2）不同限制酶切割产生的粘性末端 2、平末端连接 目的基因 载体 RE RE T4 DNA ligase 重组体 载体自连 目的基因 自连 3、同聚物加尾连接 末端转移酶 AAAA AAAA TTTT TTTT A A AA AAAA TTTT T T T T 4、人工接头连接 利用不同限制酶切位点进行定向连接 PstI EcoR I （四）重组DNA导入受体细胞 1、受体细菌的要求 　　安全、限制酶缺陷、其他 2、感受态细胞(competent cell) 3、导入真核受体细胞的方法 　　磷酸钙转染、DEAE（二乙胺乙基）葡 聚糖介导转染、电穿孔、脂质体转染、 显微注射、基因枪粒子轰击法 * * 第一节 DNA重组 一、同源重组 内切酶 (r