兔出血症病毒v60蛋白与膜突蛋白相互作用的鉴定.pdfVIP

摘要 disease 兔出血症(Rabbithemorrhagicdisease，RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic 病于1984年在中国首次报道后，在世界各地相继发生。迄今，RHD已成为兔的一种毁灭性传染 病，给养兔业带来了巨大的经济损失。 究学者至今仍未发现一株能进行RHDV稳定繁殖的细胞系，故而就缺少一个可以从分子水平研究 病毒的技术平台，这严重阻滞了对RHDV的研究，因此，RHDV致病的分子机理至今仍不十分 清楚。在RHD的发生发展过程中，肝脏是病毒增殖的主要器官。临床病理解剖中肝脏的病理变 化最为严重，并且在RHDV大量制备纯化的方案中，病死兔的肝脏往往是病毒的重要来源，研究 者直接取肝脏匀浆后提取病毒，所以从肝脏细胞出发，寻找与RHDV相互作用的细胞表面蛋白具 用的兔肝细胞表面蛋白，对了解RHDV致病的分子机制以及RHD的防控具有重要意义。 本研究拟采用SMART技术，将兔肝脏eDNA定向克隆到pEXP．biL．细脏肝兔建构，中体载 胞的真核表达文库。采用表达克隆法筛选文库，以纯化的VP60为诱饵蛋白，从真核表达文库中 筛选能与VP60蛋白发生相互作用的蛋白。通过免疫共沉淀试验、血凝抑制试验，体外验证蛋白 之间的相互作用；借助激光共聚焦试验技术证明蛋白在细胞内的共定位。实验结果表明，兔肝脏 细胞真核表达文库的鉴定结果显示插入片段分布在O．3kb～2．0kb之间，重组率约为86％，表明 获得了高质量的兔肝脏细胞真核表达文库。筛选结果显示有26个EST片段与兔功能基因有较高 态细胞，诱导表达并纯化获得可溶性Moesin蛋白，通过免疫共沉淀试验和血凝抑制试验验证 了Moesin与VP60在哺乳动物细胞内能够通过相互作用达到共定位。 本研究通过表达克隆法从兔肝细胞真核表达文库中筛选到Moesin基因，并在体外成功表达 了Moesin部分片段基因，证明了其与RHDV VP60蛋白之间存在相互作用，为RHDV致病机理 的研究奠定了基础。 关键词：兔出血症病毒，VP60蛋白，Moesin，相互作用 Abstract Rabbit an diseaseof rabbits hemorrhagicdisease(RHD)is acute，potent,hi曲lycontagious young morethanthree months，causedrabbit disease wasfirst by hemorrhagicvirus(RHDV)．RHDreported in in China1984andoutbrokeinothercountries the world has throughout far,RHD successively．So intoa ofrabbitand threatenthe of developeddevastatingepidemic seriously farming hasbeenachieved development inRHDVresearchfromRHD’sfirst in1984so