动物组织病料中原核酸提取技术研究与应用.pdfVIP

摘 要 近年来，我国面临的动物疫病防控形势十分严峻，外来动物疫病跨境传入风险 极大。分子生物学技术以其快速、敏感、特异等优点而在动物疫病的检测、确诊工 作中得到越来越多的应用。动物组织核酸（包括 DNA 和 RNA）提取质量是影响后续 物种的分子鉴定、疫病分子生物学诊断及病原分类鉴定的重要因素。动物检疫工作 中，分子生物学检测方法的敏感性和特异性很大程度上决定于样品前处理环节（即 核酸提取过程）。本论文拟开展动物组织病料中病原核酸提取技术研究，以满足口岸 动物检疫核酸快速抽提以及实验室分子生物学精准检测的需求。 本研究的内容主要包括以下四个部分： 1、用酚抽提法、盐洗法和 TriZol 法等比较常规的核酸抽提方法及试剂盒方法 提取核酸。 2、在上述经典方法的基础上改进组装一种新的快速提取高质量核酸的方法。 3、DNA 提取应用实例：以派琴虫感染的阳性组织为模板，从组织液化、消化裂 解细胞，最后纯化整个流程对裂解液配方及工艺进行优化。将这些技术筛选组装， 确定 DNA 提取一步法组合，结合实时荧光定量 PCR 方法对所建立方法提取的 DNA 进 行质量检测。 4、RNA 提取应用实例：以灭活的小反刍兽疫病毒和口蹄疫病毒细胞培养物为材 料模板，结合二氧化硅柱纯化技术，利用实时荧光定量 PCR 技术检测所建立方法提 取 RNA 的稳定性及灵敏性。 综上所述，本研究开创性地建立了一种既能满足口岸快速检测需求，又能满足 实验室精准检测技术要求的提取核酸的方法。而且在国内是首次开展适于口岸快速、 高灵敏检测动物组织样品前处理技术的研究。本研究建立的动物组织病料核酸提取 方法为临床应用及动物的疫病检测提供了广阔的发展空间。 关键词：DNA；RNA；提取；纯化；实时荧光定量 PCR；检测 Research and Application of Nucleic Acid Extraction Technology from the Pathogen of Infected Animal Tissues Abstract In recent years, the situation of animal disease prevention and control in our country was very severe, cross-border incoming risk of exotic animal diseases was increasing. Molecular biology techniques were more and more used in the animal disease detection and diagnosis for its characters of fasten, sensitivity, specificity, etc. The quality and quantity of nucleic acids (DNA / RNA) extracted from animal tissue may affect subsequent species molecular identification ，molecular biology diagnostic of epidemic disease and pathogenic classification and identification. In animal quarantine, the sensitivity and specificity of molecular detection methods were largely determined by the sample preparation (ie, process of nucleic acid extraction). So nucleic acid extraction techniques from the pathogen of animal