奶牛乳中酮体检及其与血酮的关联性研究.pdfVIP

奶牛乳中酮体检测及其与血酮的关联性研究 摘要 本文对酶荧光法检测奶牛乳中p一羟丁酸的适宜反应条件、乳样前处理方 法、准确度和精确度等进行了系统研究，并对乳中与血中B一羟丁酸浓度进行了 相关性研究。 试验一通过三个方面的试验测试，系统研究了酶荧光法的适宜反应条件。 试验反应体系由底物p一羟丁酸与工作试剂(由p一羟丁酸脱氢酶溶液、NAD+溶液 和Tris—Hcl缓冲液组成)构成，进行了如下三方面测定：(1)将反应体系在 时间的相对荧光强度。结果表明37。C水浴保温10分钟时，产物的相对荧光强 度比保温5分钟时提高了4．8％，保温10分钟以后各个时间点产物相对荧光强 度变化范围较小，说明10分钟为适宜的反应时间。(2)反应体系先经过37。C 水浴反应10分钟，然后100。C沸水浴中放置15分钟终止酶促反应，分别测定0、 反应时，0．25mmol／L标准液的产物相对荧光强度变异系数为l_49％，而1．5 mmol／L标准液的产物相对荧光强度的变异系数达到28．6l％，结果重现性很差。 当终止酶促反应后，两种浓度标准溶液的产物相对荧光强度均比较稳定，变异 系数在2％以内，重现性较好，因此通过沸水浴15分钟使0一羟丁酸脱氢酶失活 终止酶促反应，可以提高检测结果的准确性。(3)设定工作试剂中D一羟丁酸脱 沸水浴终止反应后，测定反应体系的相对荧光强度。结果发现三组产物相对荧 光强度之问有极显著差异(PO．01)，其中3U／ml浓度进行反应的产物生成量 最高，是4U／ml组的2倍，2U／ml酶剂量组次之，因此利用酶荧光法测定B一羟 丁酸含量的适宜反应酶剂量为3U／ml。 试验二研究了不同前处理对乳中B一羟丁酸测定准确性的影响。采用四种方 法对乳样进行脱蛋白处理：(1)乙酸法：将乳样和乙酸等体积混合；(2)三氯 乙酸法：将乳样和三氯乙酸等体积混合；(3)磷钨酸沉淀法：将乳样、磷钨酸 和硫酸按1．5：0．5：4的比例混合均匀；(4)乙酸锌和亚铁氰化钾法：取lml乳 样，加入35p1乙酸锌溶液、35t．tl亚铁氰化钾溶液和lm]的双蒸水，均匀混合。 入工作试剂进行测定。研究表明，乳样不经任何处理或使用乙酸法、三氯乙酸 法及乙酸锌和亚铁氰化钾法进行脱蛋白处理时，乳样反应不彻底，变异程度较 大，不能准确反映测定结果，而且检测的乳中8一羟丁酸含量均高于1．8mmol／L， 超出了健康奶牛的正常范围值(1．6mmol／L)，说明乳样未经处理和此三种处理 方法在测定过程中存在干扰。而磷钨酸沉淀法处理的奶样进行酶促反应较为完 全，且检测的乳中B一羟丁酸含量为1．05mmol／L，在健康奶牛的正常范围内，说 明该方法处理的比较干净，干扰比较小。另使用该四种脱蛋白处理方法分别对 1．Oumaol／LB一羟丁酸钠进行处理，磷钨酸沉淀法对溶液的浓度影响较小，误差 仅为6％，而乙酸法和三氯乙酸法的误差达到40％和50％，乙酸锌和亚铁氰化 钾法对溶液浓度的影响最大，测定浓度为原浓度的4倍。因此，该试验进一步 说明磷钨酸沉淀法是较好的乳样前处理方法，使用该方法能够较为准确地反映 乳中的B一羟丁酸含量。 试验三按照美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)制定的标准对酶荧 光法进行了精密度和准确度的研究。精密度采用样品重复性试验进行评价，用 浓度为1．0、2．5和4．Ommol／L B一羟丁酸钠标准溶液，批内重复性检测采用同 一个样品重复20次同样的处理和测定，批间重复性检测是对同一个样品重复同 样的处理和测定，每天测定一次，测定10天。准确度采用样品回收率试验进行 羟丁酸钠标准溶液，用磷钨酸沉淀法进行脱蛋白处理后，测定样品的相对荧光 强度，计算回收率。结果表明，酶荧光法测定B～羟丁酸的线性范围为O～ 乳中B一羟丁酸的平均回收率为93．9％，样本变异系数批内1．36％，批间3．93 ％，重复性较好。 试验四评定了乳中p一羟丁酸浓度与血中D一羟丁酸浓度的关联性。试验选用 II 酸浓度，同时使用试剂盒测定该105头奶牛血清B一羟丁酸浓度以及血清葡萄糖、 游离脂肪酸、甘油三酯和镁的含量。结果表明，不同产奶量奶牛乳中D～羟丁酸 浓度与血中浓度的相关系数为0．7645～0．9208，相关系数随产奶量的下降而下 据乳中p一羟丁酸浓度估算出血中p一羟丁酸浓度，较好地反映体内酮体代谢状 况。试验选用的不同产奶量奶牛乳中和血中B一羟丁酸含量的检测