奶牛乳房炎金黄葡萄球菌亚单位疫苗的构建及其效力检测.pdfVIP

万方数据 PreparationandPotencyTestingofSubunitVaccineofthe StaphylococcusAureusfromMatitisinDairyCows ADissertationSubmittedto ShiheziUniversity InPartialFulfillmentoftheRequirements FortheDegreeof MasterofAgriculture By SONGZhan-hui ( asicVeterinaryMedicine) DissertationSupervisor:Prof.ChenChuang-Fu June， 2014 万方数据 万方数据 万方数据 摘要 奶牛乳房炎是奶牛养殖中常见的多发性疾病，是造成奶牛养殖业严重经济损失的疾病之一，同 时危害人类健康和公共卫生，金黄色葡萄球菌是其主要病原之一。防治上由于药物残留和细菌耐药 性的不断增强和蔓延，疫苗被认为是最有效的手段。黏附素存在金黄色葡萄球菌表面，是一类识别 并特异性结合细胞和组织特殊结构及相关蛋白，荚膜多糖是细菌在宿主及环境生存的重要表面结构， 与载体蛋白结合可转变为T细胞依赖性抗原。纤黏蛋白(FnBP)和纤黏蛋白原凝集素A(ClfA)存在于 几乎所有的金黄色葡萄球菌，ClfA 的黏附作用位于其蛋白的A 区域(221～550aa)内，5型荚膜多糖 是临床分离的主要血清型。本研究以ClfAA、FnBPA及CP5为研究对象，旨在开展金黄色葡萄球菌 亚单位疫苗的研制。 目的：奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌亚单位疫苗的构建 方法：采用PCR技术对引起奶牛乳腺炎的金黄色葡萄球菌分离株SHZ1的 ClfAA和FnBPA基 因进行扩增，利用载体pMD19-T分别构建克隆质粒，再运用酶切技术成功构建双基因表达质粒 pET-32a(+)-ClfAA-FnBPA。用不同浓度的IPTG进行4h诱导，过Ni柱使蛋白得到进一步纯化；荚 膜多糖提取时采用高压破碎菌体，释放荚膜多糖，乙醇浓缩后选用加酶法去除蛋白质和核酸等杂质， 利用NaIO 去除磷壁酸，采用100KDa和30KDa两种规格的超滤管进行2次超滤，将得到的 4 30KDa-100KDa大小的超滤液经DEAESephacel进行离子交换层析，得到的精制荚膜多糖；采用间 桥法将融合蛋白ClfAA-FnBPA和荚膜多糖CP5进行偶联，偶联物免疫小鼠后，用间接ELISA法检 测抗体水平，并进行小鼠攻毒实验，对偶联物免疫效力进行检测。 结果：不同浓度的IPTG经4h诱导后，离心上清液进行SDS电泳检测，结果显示，重组 蛋白得到了高效表达，大小为100kDa左右，在上清中以可溶形式存在，表达量随IPTG浓度的增加 而减少。经Western-blotting检测，蛋白显示良好的抗原性。重组蛋白过Ni柱，SDS结果显示， 蛋白得到进一步纯化。 CP5提纯后，利用苯酚-硫酸法对其糖含量进行测定。结果显示，得到纯化荚膜多糖348.64mg， 纯度为65.46%，净产量为6.34mg/L。利用核酸蛋白仪对精制多糖中核酸和蛋白质的含量进行测定， 结果显示，核酸含量为0.1128mg/mL，蛋白质含量为0.0149mg/mL，可见提取物中大部分的核酸及 蛋白质物质已被除去，5型荚膜多糖被成功提取。用不同剂量的CP5免疫小鼠，间接ELISA结果显 示，纯CP5不能刺激机体产生应答，不能产生特异性抗体。 ClfAA-FnBPA和CP5偶联后