奶牛乳房炎金黄葡萄球菌荚膜多糖主要血清型的鉴定及cap8j基因的克隆表达.pdfVIP

摘 要 奶牛乳房炎是影响国内外奶牛养殖业的主要疾病之一，金黄色葡萄球 菌（S.aureus ）是引起奶牛乳房炎的主要病原菌。94% ~ 100% 的 S.aureus 含有荚膜多糖，荚膜多糖是 S.aureus 菌体最外层保护性结构成份，与 S.aureus 抗多形核白细胞的吞噬作用有关。由于受到药物残留，细菌耐药 性等因素制约，疫苗被认为是目前防治奶牛乳房炎最有效的手段和措施。 为了解内蒙古地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌荚膜多糖的主要血清 型，本实验从内蒙古地区采集 236 份患奶牛乳房炎的病牛奶样，采用常规 微生物方法、生物化学反应方法、动物实验对引起奶牛乳房炎的 S.aureus 进行了分离鉴定，并采用 PCR 方法和玻片凝集试验对分离鉴定得到的 S.aureus 荚膜多糖的血清型进行了鉴定。结果分离得到 162 株葡萄球菌， 其中金黄色葡萄球菌 124 株、表皮葡萄球菌 29 株和腐生葡萄球菌 9 株；动 物实验结果得到 116 株致病性 S.aureus ；PCR 方法和玻片凝集试验结果鉴 定出荚膜多糖 8 型(CP8) 的S.aureus 61 株，占致病性 S.aureus 的 52.59% ， PCR 方法结果鉴定出荚膜多糖 5 型(CP5) 的 S.aureus 23 株，占致病性 S.aureus 的 19.83% ，荚膜多糖 5 型和 8 型的 S.aureus 占致病性S.aureus 的 72.42% 。本研究表明 5 型和 8 型是内蒙古地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌 荚膜多糖的主要血清型。 在金黄色葡萄球菌荚膜多糖的主要血清型鉴定的基础上，本实验对分 离自内蒙古地区的金黄色葡萄球菌荚膜多糖主要血清 8 型的 cap8J 基因进 行了克隆和核苷酸序列分析，结果表明所扩增序列与 GenBank 中已有序列 同源性达98% ，并利用pET 32a 表达载体成功表达了 cap8J 基因，SDS 电泳检测结果表明，重组菌株表达出了 17 KD 左右的目的蛋白，该融合蛋 白为可溶性蛋白， 30 ℃，5h 是蛋白采用 IPTG 诱导的最佳表达条件。利用 CP8 单克隆抗体对融合蛋白的抗原性进行检测，玻片凝集试验结果显示， 融合蛋白与 CP8 单克隆抗体发生特异性凝集反应，表明该融合蛋白具有抗 原性。本研究将为奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌荚膜多糖基因工程疫苗的研 制奠定基础。 关键词：奶牛乳房炎；金黄色葡萄球菌；荚膜多糖；cap8J ；克隆表达 Identification of Main Serotype Capsular Polysaccharides and Cloning Expressing of the cap8J Gene of Staphylococcus aureus Isolated from Bovine Mastitis Abstract Mastitis is one of the largest production concerns in the dairy industry worldwide. Staphylococcus aureus (S.aureus) is the most common etiologic agent of mastitis in bovines and a major cause of economic losses in the dairy industry.94% - 100% S.aureus contain capsule polysaccharide wh ich is the protective structive ingredients of the bacteria.The capsule impedes phagocytosis of the polymorphonucl