猪附红细胞体双夹心elisa检测方法及小鼠病理模型的建立.pdfVIP

猪附红细胞体双抗夹心ELISA 检测方法 及小鼠病理模型的建立 摘 要 本研究建立了猪附红细胞体双抗夹心 ELISA 检测方法，通过不同 传播途径建立小鼠感染模型，并对通过腹腔注射建立的模型进行了病 理组织学研究，主要工作如下： 一、猪附红细胞体双抗夹心 ELISA 检测方法的建立及应用 将通过水浴-过滤法分离纯化的具有较强感染力的附红细胞体，按 常规程序免疫家兔与小鼠，得到高效价的阳性血清。并通过反应条件 的优化（捕获抗体 1:200 稀释，4 ℃包被过夜，1 % 明胶溶液37 ℃封 闭 1 h，检测抗体 1:400 稀释，37 ℃作用2 h ，酶标二抗 1:8000 稀释， 37 ℃作用 1 h，37 ℃显色 10 min）及敏感性(最低检出量为 3.812 μg/ml) 、 特异性、重复性实验（组间、组内的变异系数分别为 6. 57 %、4.58 % ） 的验证，建立了稳定的双抗夹心ELISA 检测方法。 对上海地区采集的 91 份猪血样的临床检测中，本试验建立的双抗 夹心 ELISA 方法，检出阳性率为 53.8 %；略低于PCR 检测结果阳性率 57.1 %，高于瑞氏-姬姆萨染色镜检法（34.1 % ）。说明本方法具有较高 的可行性，且操作简便，为诊断试剂盒的研制奠定了基础，适用于基 层大规模检测。 二、猪附红细胞体传播途径的初步研究 本实验利用 SPF 昆明小鼠作为模型动物，将从阳性猪血中分离纯 化的附红细胞体，以腹腔注射方式感染小鼠，以健康猪血分离物注射 小鼠作为阴性对照，同时设立了饮水组（在小鼠日常饮水中加入纯化 的附红细胞体）、接触组（小鼠本身未做处理，但与攻毒组同笼饲养） IV 及空白组（小鼠未作任何处理），欲对其传播途径进行初步的研究。 采集小鼠血液，应用显微镜检、PCR 及双抗夹心 ELISA 法对附红 细胞体体内感染消长时间及分布情况进行检测。镜检表明，附红细胞 体感染的首现期为注射后第 1 d，第 5 d 感染率达到高峰（80 %左右）， 随后逐渐降低。在整个实验过程中，腹腔注射组小鼠红细胞变形严重， PCR 和双抗夹心 ELISA 检测始终为阳性。而其他各组小鼠红细胞未见 明显变形，且PCR 和双抗夹心 ELISA 检测均为阴性。表明该病原不易 通过口腔、胃肠道黏膜及空气，呼吸分泌物，唾液等传播，为进一步 研究其传播途径鉴定了基础。 三、猪附红细胞体小鼠病理模型的建立 在确定附红细胞体能通过腹腔注射感染小鼠的基础上，研究感染 后临床症状、剖检、组织病理变化，为进一步揭示猪附红细胞体的致 病机理奠定基础，为其诊断提供一种手段。 研究结果显示感染组小鼠没有表现出明显的特征性临床症状，但 相对于对照组小鼠出现了精神萎靡，食欲不振，呼吸急促等现象。组 织石蜡切片表明心、肝、脾、肺、肾脏出现了不同程度的病变，而十 二指肠未见明显变化。对照组小鼠的内脏器官则均未出现明显病理变 化。组织冰冻切片免疫荧光结果显示，荧光颗粒均未附着在组织上， 而是散在分布于组织间隙中。表明附红细胞体的靶细胞只有红细胞， 为该病的病理学研究打下一定的基础。 关键词：附红细胞体，双抗夹心 ELISA ，传播途径，病理模型，免疫 荧光 V ESTABLISHMENT OF SANDWICH ELISA AND PATHOLOGICAL MICE MODEL AGAINST MYCOPLASMA SUIS INFECTION ABSTRACT This paper established a double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (sandwich ELISA) detection and mice infected model against Mycoplasma suis