表达猪轮状病毒p4基因和共表达vp4与ltb重组乳酸菌表达系统的构建及其免疫学评价.pdfVIP

摘要 猪轮状病毒是无囊膜、分节段的双股RNA病毒，隶属于呼肠孤病毒科，是引起仔猪腹 泻的重要病原之一。猪轮状病毒感染呈世界范围分布，给养猪业带来了极大的危害。 lactis caseiATCC 本研究以乳酸乳球菌LactococcusNZ9000和干酪乳杆菌Lactobacillus 393(L．easei 393)作为递呈抗原的活菌载体，以猪轮状病毒主要免疫保护性抗原VP4蛋白的 基因片段为靶基因，并插入大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基因(L1B)，构建了表达猪轮状病毒 VP4基因和共表达VP4．LTB的重组乳酸乳球菌表达系统和干酪乳杆菌表达系统，并对免疫效 果进行比较分析。 一 根据目的基因和融合表达载体质粒的特点，应用oli906．0软件进行设计引物。以 VP4．pGEX．6P．1质粒作为模板，通过PCR扩增得到大约756 bp的VP4基因，以pMD．18T-LTB 质粒作为模板，通过PCR扩增得到大约375 bp的LTB基因，PCR产物经酶切后，与带有粘 12．VP4．LTB的质粒。重组质粒 性末端的pNZSl12载体连接，得到pNZSl12．VP4和pNZ81 来诱导目的蛋白的表达。重组菌中蛋白的表达和定位通过SDS．PAGE、Western blotting和免 解物分别表达了27KD和40KD的融合蛋白，而诱导前的菌体没有目的蛋白表达。诱导后表 达的VP4和VP4．LTB蛋白经Western 条带，诱导前的菌体没有相应的条带出现。这些结果表明Nisin能有效诱导乳酸乳球菌NZ9000 中异源蛋白的表达。采用抗VP4的鼠血清进行免疫荧光试验的结果显示，pNZ8112．VP4和 12．VP4．LTB诱导后的菌体表面能看到黄绿色荧光，而诱导前的菌体则没有荧光反应， pNZSl 且细胞被伊文思蓝染成红色。 导目的蛋白的表达。重组菌目的蛋白的表达和定位也是通过SDS．PAGE、Western blotting和 有大约40KD和53KD的蛋白表达，而未诱导的菌体中没有蛋白表达。通过Western blotting 检测诱导后的菌体裂解物，可看到40KD和53KD的特异性反应条带，而未诱导的菌体则没 有相应的条带出现，这些结果表明乳糖能有效诱导L．casei393中异源蛋白的表达。通过间接 导的菌体则没有荧光反应，且细胞被伊文思蓝染成红色。 为检验重组菌是否能诱导黏膜和系统免疫应答，将BALB／c小鼠分为六组，通过口服途 1 12．VP4和 径分别免疫pPG．1，pPG．1．VP4，pPG．1．VP4．LTB，pNZ812，pNZ81 丕北农业大堂农学博士堂位论文 12．VP4．LTB。每只小鼠分别免疫109c．Cu．单位的重组菌，每次连续免疫三天，第一次 pNZ8l 加强免疫在第一次免疫后的17、18、19天，第二次加强免疫在第一次免疫后的33、34、35 天。每次免疫后的第7天收集小鼠血清；每次免疫后的l、2、7天收集粪便；眼洗液是在每 次免疫后的第7天以50皿的PBS冲洗眼结膜获得；阴道洗液是在每次免疫后的第7天用200 此的PBS冲洗阴道获得；母鼠分娩后的3、5、7天收集乳汁。所有收集的样品保存于-20℃ 备用。 为保持黏膜系统的稳定，许多防御机制都参与进行持久有效地作用。分泌性IgA的参与 也是防御机制之一，IgA抗体通过阻止病原微生物的入侵和定植并竞争受体和代谢底物。为 评价黏膜免疫反应，通过ELISA方法来检测黏膜样品中特异性IgA