蒙古绵羊绒毛膜养层细胞的体外培养与鉴定.pdfVIP

摘 要 滋养层细胞是胎盘屏障的重要组成成分，对胚胎的植入过程起重要的调节 作用。本研究旨在进行体外培养、鉴定蒙古绵羊滋养层细胞（trophoblastic cells），并对其生物学特征进行探究，来建立一种能稳定、方便地获得较高纯 度的绵羊绒毛膜滋养层细胞的方法，为后续的细胞转染和RNA干扰试验提供细胞 学基础。 经过培养不同孕期 （早、中、晚）的蒙古绵羊滋养层细胞，发现胎盘的采 集时间对细胞的贴壁率及细胞活性影响较大，确定采集胎盘的最佳时期为孕中 期。通过添加不同浓度的血清，筛选出含15% 胎牛血清 (Fetal Bovine Serum FBS)的高糖DMEM培养体系较适合细胞生长。 细胞培养初期，通过胰酶消化差速 法，去除上皮样细胞中混杂的成纤维状细胞，并在5代之内得到纯化的细胞。应 用伊红-苏木素染色法（HE），可观察到纯化的细胞形态多样，呈多角形或卵圆 形，细胞界限清楚，胞浆透明，核圆或呈小泡状。使用免疫组织化学方法，分 别检测不同孕期的正常绵羊胎盘绒毛组织，以及体外培养的滋养层细胞，结果 显示，培养的滋养层细胞中细胞角蛋白呈阳性表达，波形蛋白呈阴性表达，证 明细胞的纯度在90%以上，符合后续实验的要求纯度。应用透射电子显微镜观察 绵羊绒毛膜滋养层细胞，观察结果显示，所培养的细胞具有滋养层细胞的典型 结构，细胞表面有丰富的微绒毛，细胞质内线粒体较多，并可见电子密度较高 的脂滴，细胞核较大，细胞间可见缝隙连接结构，提示所培养细胞为绵羊绒毛 膜滋养层细胞。利用RT-PCR技术检测滋养层蛋白-1，结果显示，纯化的细胞能 够表达滋养层蛋白-1。 研究结果表明，本试验应用组织块培养法制备原代滋养层细胞，该方法简 便易行，可以有效获得较高纯度的，且具有生物学活性的绵羊绒毛膜滋养层细 胞，为本实验室后续的体外研究提供细胞学基础。 关键词：蒙古绵羊；滋养层细胞；细胞培养；逆转录聚合酶链式反应；免疫组 织化学；透射电镜 Isolation and Identification of Mongolian Sheep Chorionic Trophoblastic Cells in Vitro Abstract Aimed to study Mongolian sheep trophoblast cells in vitro and identification, and to explore its biological characteristics, to create a stable, easy access to high-purity sheep chorionic trophoblast cells for subsequent cell transfectionand and RNA interference experiments, provided a cytological basis. Develop different stages of gestation (early, middle and late) Mongolian sheep trophoblast cells and found that the placenta collection time influenced the rate of adherent cells and cell activity, the placenta collection period for the second trimester is the best time. By adding different concentrations of serum screening in DMEM, found containing 15% (Fetal Bovine Serum FBS) fetal bovine serum culture system is better,.The early of cells culture, we used different trypsin digestion time to remove the fibrous cells mixed