微生物菌种筛选与分离精品.pptVIP

3.4 酵母的杂交育种 酵母菌是双单性微生物，存在着单倍体和二倍体生活史； 酵母杂交育种有三种杂交方式：即孢子与孢子、单倍体细胞与孢子、以及细胞间杂交。 第四节 原生质体融合技术 对微生物育种来说，有性重组的局限性很大，迄今发现有杂交现象的微生物并不多，这就妨碍了基因重组在微生物育种中的应用。 原生质体融合技术提供了充分利用遗传重组杂交的方法。 原生质体融合技术首先是在动植物细胞融合研究的基础上发展起来的，然后才应用于真菌、细菌和放线菌。由于这一技术可以打破种属间的界限，提高重组频率，扩大重组幅度，而倍受关注。 4.1 原生质体融合的优越性 原生质体融合方法: 首先用酶分别酶解两个出发菌株的细胞壁，在高渗环境中释放出原生质，将它们混合，在助融剂或电场作用下，使它们互相凝集，发生细胞融合，实现遗传重组。 4.2 原生质体融合方法 原生质体融合技术包括: 原生质体制备，原生质体融合，原生质体再生和融合子筛选等步骤。 1）原生质体制备 使用各种酶分别酶解两个出发菌株的细胞壁，释放出原生质体;为防止原生质体内部渗透压过高而破裂，必须将原生质体释放到高渗溶液中。 各种微生物细胞壁组成不同，须采用不同的原生质体制备方法。 革兰氏阳性枯草杆菌和巨大芽抱杆菌的细胞壁——溶菌酶； 黄色短杆菌的原生质体制备是先加青霉素培养1.5h后，再用酶消化； 革兰氏阴性细菌则要采用EDTA加溶菌酶，或甘氨酸一溶菌酶一EDTA，或在含青霉素培养基培养等条件下制备原生质体； 链霉菌一般在含甘氨酸的培养基中培养后，用溶菌酶消化； 酵母的原生质体制备是首先接种在疏基乙醇和EDTA的溶液中培养，再用细胞壁溶解酶消化获得。或者用蜗牛酶或纤维素酶消化时，添加疏基乙醇来提高原生质体的形成率。 几丁质酶、蜗牛酶、纤维素酶、硫酸脂酶多用于制备霉菌的原生质体。 2) 原生质体融合和再生 两个出发菌株制备的原生质体可以通过化学因子或电场诱导的方法进行融合。 化学因子诱导：采用聚乙二醇（PEG）4000和6000作为融合剂，并加Ca2+和Mg2+等阳离子。 电融合过程是原生质体在电场中极化成偶极子，并沿电力线方向排列成串，再加直流脉冲击穿原生质体膜，导致原生质体融合。 融合后的原生质体具有生物活性，但由于缺少细胞壁，不是正常的细胞，不能在普通培养基上生长。所以要涂布在高渗培养基上令其再生。可以增加高渗培养基的渗透压或添加蔗糖来增加再生率。 3) 融合子的检出 融合子是在选择性培养基上检出，即通过两个遗传标记互补确定的，如利用营养缺陷型互补，在基本培养基上识别融合子。 当亲株没有或很少标记的情况下，可利用灭活的原生质体（单亲株或双亲株灭活均可）融合，筛选有生物活性的重组子。 此外可以利用荧光染色，将两个亲株用不同的荧光色素染色并融合后，在落射荧光装置的立体显微镜下观察融合子；如在一个个体上观察到双亲的两种荧光色素，即为融合子。 通过上述方法产生的融合子如果产生了杂合双倍体或单倍重组子，其遗传性状比较稳定。但也可能产生的融合子是一种短暂的融合，会再次分离成亲本类型。所以还要再进行多次筛选，找到稳定的融合子。 第五节 基因工程技术 基因工程或DNA体外重组技术：将外源DNA通过体外重组后，导人受体细胞，使其在受体细胞中复制、转录、表达的技术。 基因工程菌产生的主要程序包括：目的基因的克隆，DNA重组体的体外构建，重组 DNA导人宿主细胞以及基因工程菌的选择。 第六节 菌种保藏 菌种的保藏方法很多，其基本原理是：根据微生物的生理生化特性，人为地创造条件，使微生物处于代谢不活泼，生长繁殖受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。一般可以通过降低培养基营养成分、低温、干燥和缺氧等方法，达到防止突变、保持纯种的目的。 菌种保藏的方法很多，一种好的保藏方法除了能长期保持菌种原有的优良性状不改变外，还应简便、经济，以便在生产上能广泛使用。 6.1 斜面保藏法和穿刺保藏法 6.1.1 斜面保藏法 6.1.2 穿刺保藏法 6.2 沙土管干燥保藏法 6.3 真空冷冻干燥保藏法 6.4 液氮保藏法 6.5 悬液保藏法 6.6 低温保藏法 微生物菌种分离筛选与育种 发酵工程的生产水平由生产菌