鉴别猪瘟病毒野株和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量rt-pcr方法的建立与评价.pdfVIP

摘 要 swine 猪瘟(Classicalfever，CSF)是由猪瘟病毒(Classicalvirus，CSFV) swinefever 引起的一种高度接触性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列入OIE疾病名录(OIEListed 了很大的变化，在临床表现上趋于非典型化，主要表现为隐性带毒和慢性感染，成为影响养 猪业发展的一大隐患。CSFV跟同属的牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV．1)、牛病毒性腹泻病 of 毒2型(BVDV一2)、绵羊边界病病毒(BDV)和长颈鹿瘟病毒(Pestivirus giraffe)都属 以感染猪，与CSFV存在血清学交叉反应，因此给猪瘟诊断造成一定干扰．此外，猪瘟兔化 弱毒疫苗(HcL、，)在我国的大规模应用，为控制猪瘟起到了重要作用，但同时也给传统的 诊断方法对CSFV野毒感染猪和疫苗接种猪的鉴别诊断带来较大困难。 本研究旨在建立一种复合荧光定量RT-PCR方法，用于CSFV野毒株与兔化弱毒疫苗株 析。在其5’端非编码区设计了一对针对CSFV的通用引物和两条分别针对不同基因亚群的 株和兔化弱毒疫苗株的敏感、特异、重复性好的复合荧光定量RT-PCR鉴别诊断方法．该方 瘟兔化弱毒疫苗株完全区分开来，在l矿．101拷贝，m，范围内，对CSFV野毒和兔化弱毒疫苗 标准品模板的检测具有良好的线性关系，分别可检测到初始模板中41．8个(野毒)或81．5 近，二者对152份不同样品(包括细胞培养物和临床现地样品)检测阳性符合率分别为96．2％ 发现，野毒阳性率为30．2％(32／106)。 RNA 应用本方法对人工感染106TCID50猪瘟石门强毒的猪只感染后O一14d全血中CSFV 进行了定量检测，揭示了CSFV在猪体内复制的动态变化，同时发现，人工感染猪在感染后 第2天在其全血中就可检测到病毒RNA，而同居感染猪在出现猪瘟临床症状前34d可从其 全血中检出病毒RNA。 应用本方法对8份猪瘟兔化细胞疫苗原液效价的检测，证实本方法与兔体反应热法在疫 苗效价测定上具有良好的相关性，初步确定细胞疫苗样品中病毒RNA的含量为2．23x107拷 贝／nO．,(相当于5x104RIDso)以上时才可以用于制苗。 本方法可以及早对猪瘟爆发做出准确快速诊断，防止疫情蔓延；可以将CSFV野毒感染 猪迅速从免疫猪群中筛查出来并予以清除。有利于猪瘟的净化和无猪瘟疫区的建立{同时本 方法还可辅助传统的兔体定型热反应用于猪瘟疫苗效价估测、CSFV致病机制研究以及猪瘟 疫苗免疫攻毒保护效力评价。 关键词：猪瘟病毒，猪瘟兔化弱毒疫苗，复合荧光定量RT-PCR，TaqMan探针，鉴别诊断 Abstract Classicalswine Classicalswine a fever(CSF)，causedby fevervirus(CSFV)，ishighly disease oneofOIEListeddiseases．Inrecant has alot contagiousofpigs，and years，CSFchanged underthe ofmassvaccinationin in or inclinicalmanifestations pressure China,resultingatypical fromacute economiclossesin chronicforms different CSF，and