h3n2亚型猪感病毒ha1蛋白间接elisa方法的建立及np蛋白单克隆抗体的制备.pdf

摘 要 基因获得表达，重组蛋白以包涵体的形式存在。通过改变IPTG的浓度和诱导时间，确定表达HAl 基因的最佳诱导条件：IPTG终浓度为0．8mmol／L，诱导时间为4h。表达产物经SDS．PAGE分析， 结果显示H3N2亚型猪流感病毒HAl基因在原核表达系统中已表达，HAl蛋白表达量占细胞总 蛋白的40％分子量近似42KD。Westernblot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。 用纯化的表达产物作为诊断抗原建立了检测H3亚型猪流感病毒抗体的间接ELISA方法，确 猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病等猪病的阳性血清发生交叉反应。与HI作对比实验，同 时对来自不同地区患有呼吸道疾病的309份现地猪血清进行检测，检测结果表明ELISA方法的特 异性和敏感性都较高，并且两者的符合率达到89％以上，建立的间接ELISA方法为H3亚型猪流 感病毒抗体检测提供了快速、准确、简便的方法。 毒株作为免疫原，免疫8周龄BALB／C雌性小鼠，三次加强免疫后取脾细胞与SP2／0细胞融合， 利用全病毒包被ELISA方法检测筛选，阳性细胞克隆经有限稀释法克隆培养，最后获得H3亚型 4株单抗进行Westernblot分析，4株单抗均在约56KD出显示单一条带。故判定4株单抗为针对 l 为lgM。4株单抗经间接ELISA检测均不与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病毒反应，具 有一定的型特异性。 关键词： 猪流感病毒H3N2原核表达系统间接ELISA单克隆抗体 Abstract a of totherelevantnucleotide of Usingpair specific designed primers according sequence HA l ofH3N2 swineinfluenzavirus A／Swine／Heilongiiang／I／05(H3N2)fromGenBank，thegene subtype with RT-PCRmethod．ThePCR Wasclonedinto a (SIV)wasamplified product pET-32a(+)and recombinant 1 Was was inthehostcellBL2l plasmidpET-HAgenerated．Thetargetgene expressed wheninducedwithIPTG．The Was with conditionof successfully expressionoptimizedproper inducing 0．8mmol／LIPTGand4hours．SDS—PAGEresultshowedthattheHAl Was in gene expressed the takethe of40％(42KD)in prokaryoticexpressionsystem，andtargetprotein proportion thewhole blot therecombinanthas proteinbyscanningassay．Westernanalysisproved proteingo