taqman-gb探针双重荧光定量pcr方法绝对定量mdv-ⅰ和hvt.pdf

摘要 马立克氏病(Marek’SDisease，MD)是由马立克氏病病毒(Marek’SDisease Virus，MDV)引起鸡的一种恶性淋巴肿瘤性疾病，具有高度接触传染性。由于该 癌症病的隐蔽性极强，又没有治疗手段，其主要预防措施是1日龄内接种疫苗。但 疫苗仅阻止发病而非感染，因此对MDV的感染或污染进行特异性的诊断和监测十 特别是可以定量测定病毒拷贝数的优点为检测MDV提供了很好的方法。 疱疹病毒(HVT)Bcl一2基因序列，用Primer3．0软件分别设计了MDV-I Express 的浓度进行了优化，并在不同退火温度和不同循环数下进行了优化反应，确立了最 佳反应体系和反应条件，通过双重实时荧光定量PCR的不交叉反应，最终建立了 性强，对新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊 病毒及鸡胚成纤维细胞提取的DNA均未扩增出荧光定量曲线；将放置不同时间的 的域值(CT)的变化很小，组内组问变异系数均小于5％，表明本试验建立的方法 FQ-PCR检测，结果表明FQ—PCR的检测灵敏度高出普通PCR100倍。pBJ—U和 pHV．B质粒DNA标准样品分别稀释至l 电泳结果已经不清晰。 通过对实验鸡和临床发病鸡的检测，得出本试验建立的双重荧光定量PCR方 法可以灵敏地定量检测到MDV一1。在临床发病鸡检测的不同组织样品中，MDV-I 含量为103‘5—6拷贝数／mL，羽囊中病毒含量最高，达10蹦拷贝数／mL；通过对实验 免疫攻毒鸡羽囊样品的检测，发现HvT疫苗在一定程度上抑制了MDV．1在体内的 复制，使羽囊排毒高峰延迟了两周，与攻毒对照组相比其高峰值下降10M拷贝数 ／mL；MDV一3在HvT免疫攻毒组的羽囊中的病毒含量要高于免疫对照组，并且 MDV．3在羽囊中的整体复制水平都不高。 总之，该方法将为MDV强毒污染监测、临床鉴别诊断、MD发病机理以及疫 苗免疫机理的研究提供一种良好的技术手段。 IV Abstract Marek’S a ot disease(MD)ishighlycontagiousamalignantiymplaomacluckens， causedMarek’Sdisease tothe ofthiscancerdiseaseand by virus(MDV)．Duecrypticity at chickenwas of lackof inoculation1 oldof asone tool，vaccine regarded therapeutic day main inoculationdeathotherthan proventivemeasures．However,vaccineprevents and the of infectionininfected is to monitorstatus chicken，itvery importantdiagnose or characterized MDVinfection contamination．TaqMan·MGBFQ—PCR byquick， a