伪狂犬病病毒、细小病毒和流行性乙型脑炎病毒检测基因芯片的构建及检测技术研究.pdf

婴型奎些查兰竖主望苎——————————————————一 中文摘要 片检测新技术，该基因芯片技术对PRV、PPV和JEV具有同步检测和鉴别诊断，同时 对PRV的野毒株和基因缺失疫苗株也具有鉴别功能。主要内容为以下几个部分： lI PRV—PPV—JEV检测基因芯片靶基因克隆及鉴定 PPV和JEV基因序列，采用Array NS2、 NSI、T／B1VP2、T／SR_1NSl、T／SR-1 选获得了T／gB、T／gG、T／TK、T／gE、T／B1 NS3、T／SR-lVPl、T／SR—l T／SR—l Fa株， 组质粒。经序列测定和对位排列分析，结果为gB、∞、gE、TK靶基因扩增自PRV 分别为PRY NSI、S肛lNS2、SR一1NS3、SR一1VPI、 NSI、B1VP2扩增自PPVBl株，SR—l PPV靶基因BI SR-1 VP2扩增自PPV 209bp、471bp；JEVC、PrM／M、E、NSI和NS5靶基因扩增自5EVSAl4—14—2株，分别 为jEv 度保守性基因，为PRV—PPV—JEv检测基因芯片的构建提供了确实可靠的材料。 2．PRV—PPv_JEV检测基因芯片的构建 本试验研究了PRY—PPV—JEV检测基因芯片靶基因和探针制备方法、靶基因杂交温 度和特异性，确定了构建诊断芯片的靶基因及其浓度和有关芯片质量控制方法，结果 如下。 1)靶基因和定位对照基因的制备以靶基因重组质粒DNA为模板，采用PCR扩增、 异丙醇沉淀法纯化靶基因，其浓度和纯度符合芯片制作要求，定位对照基因制备 参照曹三杰(2004)报道方法进行。 2)探针的制备 u 探针，Cy3一dCTP的使用终浓度为2．5 L mol／L，制备的探针浓度在121—748ng／p 之间。 3)本试验确定了靶基因最适点样浓度为200ng／ⅡL，芯片系统灵敏度为3pg／uL探 针，筛选出杂交信号强、杂交特异性好的靶基因及其杂交温度，确定了 PRV-PPV—JEv检测基因芯片的预杂交时间为1h和杂交时间为6h。 中位值模式，总信号模式输出的样点信号强度与背景之比为SNR。 TK、PRV 5)基因芯片制备和质量控制研究确定PRVgB、PRVgG、PRV B1 gE、PPV VP2、PPVSR-lNS2、PPVSR-1NS3、PPVSR一1 VPI、JEVC、JEV PrM／帆JEyE， 中文摘要 NSI、JEV JEV 点样缓冲液将靶基因和定位对照基因稀释至200ng／u 样系统将靶基因分配到Baio哟夏基化基片微阵列表面，室温干燥过夜，60—80C水 干燥，密封、室温保存。芯片质量控制采用靶基因杂交检测和片间重复性试验， 结果为靶基因杂交信号中位值≥1000，片间差异小。表明构建的诊断芯片质量稳 定、靶基因确实。 3．PRV-PPV—JEV检测基因芯片检测技术研究 1)研究确定了探针制备方法采用多重PCR扩增标记Cy3以制备探针。