利用微阵列技术究猪卵泡发育相关基因的差异表达.pdfVIP

摘要 为了研究哺乳动物卵泡发育的分子机制，我们利用猪作为实验材料研究卵泡发育的基因表达 图谱。本研究选择了猪卵泡发育过程中最具典型代表性的三种卯泡作为研究对象，分别为原始卵 泡(简称P)、发育中期卵泡(即腔前卵泡，简称M)和发育后期卵泡(即大有腔卵泡，简称L)， 分别用不同的方法从青春期猪的卵巢上分离获得。然后用芯片杂交的方法获得卵泡发育的基因表 达图谱，经过数据分析找到了卵泡发育有关的差异表达丛因。本文在卵泡的分离和卵泡发育有关 基因的研究两方面得到如下结论或推论： (1)本研究在前人研究的基础上，通过增加密度梯度离心后的候选细胞层数进一步提高了原 始卵泡的分离产量，对于单个青年猪卵巢而言，原始卵泡的分离产量从原来的 1 85×105-2 31％±O．73％， 色，流式细胞仪分析发现大直径细胞簇中原始卵泡的含量仍然可以达到98 表明改进的分离方法可以在保证纯度的同时大大提高原始卵泡的产量。 (2)通过Giemsa乖IHoechst33342染色方法可以为原始卵泡的鉴定提供旁证，尤其是生殖细胞 特异表达的蛋白——MsY2的免疫荧光染色可以更科学准确地判断原始卵泡的纯度。 (3)猪的卵巢具有较多的结缔组织，分离直径较大的腔前卵泡(100-400Hm)更适合使用机械 的方法(如显微剥离法、剪碎法)，不适合使用梳刮法或酶消化法，这两种方法产量低(扛4 枚／卵巢)而且容易造成卵泡的损伤。 (4)本研究利用芯片杂交的方法获得了猪卵泡发育的基因表达图谱。原始卵泡阶段与后两个 阶段的基因表达存在较大差异，而后两个阶段之间的基因表达之间却存在较高的生物学 相关性(一=0．892)，这些表明卵巢|_I!|原始卵泡库的维持需要复杂的控制机制，而原始卵 泡内部需要经历深刻的基因表达变化才能开始启动生长。 (5)猪卵泡发育过程中差异表达基因的分布特征表明，原始卵泡被募集启动生长后遵循大致 相同的生艮发育调控途径，只不过在不同阶段有更细微调控代谢途径；而且随着生长的 进程卵泡的发育潜力逐渐降低。 (6)5，848个差异表达基因在不同发育阶段呈现规律性分布，这些特征为哺乳动物中普遍存在 的三个生殖生物学现象的科学解释提供了一定的分子证据。 (7)在不同的基冈群中选择了4类共25个代表性基因进行O．PCR验证，结果显示所有这些 基因表达变化趋势与芯片杂交反映的结果起完全吻合；其中一些基因的表达变化情况符 个角度证明了本研究筛选得到的卵泡发育相关基冈准确可靠、具有潜在的应用价值。 (8)本研究找到了进一步研究卵巢中原始卵泡库维持静止状态的重要候选基因(如“P—up”基 因群)；同样为卵泡的生长启动机理提供了重要而有价值的参考候选基因群(如“ML—up” 和“M—up”基因群)。 (9)不同阶段特异上调或下调表达基因(群)的获得可以为卵泡发育中的其他生物学现象(如 卵泡的闭锁、卵泡腔的形成、卵泡的优势化等)提供有益的候选基因群。 总之，本研究获得的差异表达基冈群为今后进一步深入研究猪乃至整个哺乳动物的卵泡发育 提供了一个有价值而重要的候选基田数据库。 关键词：猪，卵泡，发育， 芯片， 差异表达基因 ABSTRACT Inordcrtoresearchmolecular mechanismsofmammalianovarian developmental follicle，porcine as to ovarianfollicleswereselected research The ofthe wasfind targetsobjective representative study ovarianfollicles related