哮喘易感基因aam33对气道平滑肌细胞力学行为的影响.pdf

Modulation of ADAM33 gene Expression Alters Biomechanical Behavior of Airway Smooth Muscle cells A Thesis Submitted to Chongqing University In Partial Fulfillment of the Requirement for the Doctor’s Degree of Engineering By Jiaoyue Long Supervised by Prof. Linhong Deng Specialty：Biomedical Engineering College of Bioengineering of Chongqing University, Chongqing, China October, 2012 中文摘要 摘 要 哮喘病是一种常见的呼吸道慢性炎症疾病，是指支气管在高反应状态下，由 变应原或其他因素引起的气道狭窄的疾病，主要症状有胸闷、咳嗽、呼吸困难等。 气道平滑肌细胞﹙Airway Smooth Muscle Cell ，ASMC ﹚是呼吸道的主要组成部分 之一，具有重要的生理作用。当气道平滑肌在受到外来因子的刺激时会发生气道 过度收缩反应（Airway hyperrespinsiveness ，AHR ），临床表现为患者气道过度缩 窄和发作性呼吸障碍，这是导致哮喘病成为高危疾病的最终原因所在。虽然在哮 喘病的研究当中，对ASMC 收缩特性的认识已经有一个多世纪，但是关于气道平 滑肌病理变化的机制却没有研究透彻。气道平滑肌是控制气管管径的效应器，其 病理性收缩成为气道阻塞和呼吸困难的最终因素，它在决定哮喘病治疗方法的有 效性方面起到关键的作用，普遍认为其病理性收缩是哮喘难治的重要的病理基础。 去整合素碱金属蛋白酶33 （A disintegrin and metalloprotease 33 ，ADAM33 ）基因 已被证实是一个哮喘易感基因，且在大部分哮喘患者的气道平滑肌和基底膜上其 表达水平较健康受试者要高，说明 ADAM33 可能参与ASMC 力学环境的调控， 进而与哮喘病人ASMC 力学特性异常及气道重构有关。然而，至今还没有直接的 证据证明ASMC 生物力学行为与其ADAM33 表达之间的关系。因此，本文采用 分子生物学方法调控ASMC 的ADAM33 表达，同时采用细胞生物力学方法测量 超表达和沉默 ADAM33 的ASMC 的力学行为，以揭示二者之间的直接关系。本 文的主要研究内容和研究结果如下： ①ADAM33 的表达水平随着SD 大鼠雾化周数的增加而显著性升高。首先， 利用氢氧化铝作为佐剂，卵清蛋白（OVA ）致敏并激发哮喘，建立 SD(Sprague Dawley)大鼠哮喘模型。每周隔天OVA 雾化3 次，每次30 分钟，共雾化 12 周， 每 2 周取大鼠肺组织。通过对肺功能（Penh ）的测定及气道组织 HE ( Hematoxylin-Eosin staining )染色观察结果表明我们已成功构建大鼠哮喘模型。接 着，利用定量RT-PCR 和Western blot 技术检测ADAM33 在OVA 雾化不同周数 的SD 大鼠哮喘平滑肌细胞中的表达，结果显示ADAM33 的表达水平随着OVA 雾化周数的增加而显著性升高，且定量RT-PCR 与Western blot 的实验结果基本一 致。从而说明ADAM33 的表达水平与哮喘的严重程度呈正相关，该结果与Lee 等 在哮喘病人中的研究发现相符合，更近一步证明我们实验中所构建的SD 大鼠哮喘 模型能真实地模拟哮喘病。 ②获得ADAM33 超表达和沉默的ASMC 。首先，构建ADAM33 基因超表达 和干扰慢病毒重组载体，然后进行慢病毒转染，以GFP 空载及未转染