堆形艾美耳球虫熟株生物学特性及其抑制消减cdna文库的构建.pdfVIP

堆形艾美耳球虫早熟株生物学特性及其抑制消减 eDNA文库的构建 摘 要 鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于鸡肠道所引起的一种危害严重的全球性寄生虫病，给养 鸡业造成巨大的经济损失。目前控制球虫病的主要方法包括化学药物防治和疫苗免疫预防， 但由于这些方法存在安全、价格以及抗药虫株出现等问题，迫切需要寻找新的防治手段来控 制球虫病。研制高效安全抗球虫病基因工程疫苗的关键在于寻找到重要的虫体抗原基因。 特性的差异，运用Jeffers创立的艾美耳属球虫早熟株选育方法对堆形艾美耳球虫(E acervulina)进行了连续18代的早熟选育，并通过对早熟株与母株的孢子化卵囊大小、繁殖 能力、致病性及免疫保护力等指标进行测定，分析了Eacervulina早熟株与母株之间基本生 物学特性的差异。 为了进一步从分子水平对Eacervulina早熟株和母株之间的差异进行分析，本研究分别 以早熟株和母株孢子化卵囊互为驱动组和实验组，利用抑制性消减杂交技术，进行了双向抑 制性消减杂交，构建了2个抑制性消减eDNA文库。随机从2个eDNA消减文库中分别挑 取50个克隆，经PCR鉴定2个消减eDNA文库的重组率为97％和98％。从每个文库中随 机挑取50个克隆测序，并进行同源性比较分析，结果显示：从早熟株消减文库中获得了20 个单一有效序列，其中9个单一序列与已知的蛋白同源性很高，主要为堆形艾美耳球虫丝氨 酸蛋白酶抑制剂、表面抗原，刚地弓形虫假想蛋白、隐孢子虫假想蛋白、泰勒虫假想蛋白、 弓形虫聚合酶等。从母株消减文库中获得了21个单一有效序列，有7个单一序列与已知的 蛋白同源性很高，主要为刚地弓形虫假想蛋白、疟原虫假想蛋白、人类ATP合成酶、鼠类 线粒体醛脱氢酶前体等。 PCR 根据序列分析获得的ESTs，从每个文库中选择4个阳性克隆基因，利用Real．time 进行分析。结果显示从母株消减cDNA文库中获得的ESTs，在母株孢子化卵囊中mRNA转 录水平高于早熟株孢子化卵囊，而从早熟株消减eDNA文库中获得的ESTs，在早熟株孢子 母株孢子化卵囊双向抑制性消减eDNA文库是比较好的，可用于进一步筛选早熟株与母株 差异表达基因。 关键词：堆形艾美耳球虫；早熟株；生物学特性；抑制消减杂交技术；实时定量PCR Lineof．邑acervulinaand ofaPrecocious Characteristics eDNA ConstructionofItsSubtractive Library Abstract of infectedEimeriainflicts coccidiosisisthe disease Avian majorparasitic poultry by spp．It diseaseconlrol severeeconomiclossesonthe industry．At strategies poultry present,conventional withlivevaccines．Duetothe have on medicationandimmunization reliedprophylactic vaccines ale