多重耐药大肠杆与整合子-基因盒系统的研究.pdf

摘要 大肠杆菌是医学和兽医临床上最常见的病原菌之一．给人类的健康和畜牧业的发展造成 了严重的损害。抗菌药在控制大肠杆菌感染方面发挥了重要作用．但随着抗菌药物的广泛应 用，导致大肠杆菌耐药株尤其是多重耐药菌株不断出现，大肠杆菌的耐药问题已成为影响人 cassette 类健康和养殖业发展的重要因素。整合子一基因盒系统(integrongene system) 介导的细菌耐药机制因能解释耐药基因的快速传播而倍受研究者们的广泛注意，并取得了很 大的进展。整合子是一个能捕获外源基因并使之转变为功能性基因的表达单位．为运动性的 DN^分子，主要见于革兰氏阴性杆菌，以肠杆菌、铜绿假单胞菌为多见，革兰氏阳性菌最近 也有报道，整合子是革兰氏阴性杆菌多重耐药性迅速发展的主要原因。整合子定位于染色体 及具有广泛宿主的质粒或转座子上，包含两个保守的DNA片段，两片段的中央区是长度和序 列可变的片段，可插入编码某种功能的基因，如耐药基因，被称为插入盒(Inserted cassette)，亦称基因盒(cassette)。细菌通过整合子系统的整合酶，捕获外来的耐药基因。 并在位于整合子上游启动子的作用下得到表达，使细菌具有耐药及多重耐药性．造成细菌多 重耐药性的传播。因此，调查研究大肠杆菌多重耐药性，扩增糌合子基因，检测整合子及其 类型对从基因水平上探讨细菌耐药性的分子机制，具有重要的理论和实践意义。本实验旨在 了解整合子一基因盒系统在多重耐药大肠杆菌中的分布、整合子的结构、传插及其介导的多 重耐药机制，探索建立一种临床大量菌株监测是否含有接合子及其类型的新方法。 本试验首次对哈市地区养殖场不同来源大肠杆菌耐药性进行了调查，并对整合子一基因 盒系统进行分析，确定了养殖场抗菌药物选择压力下，多重耐药大肠杆菌的发生发展动态， 对跟踪多重耐药大肠杆菌的扩散并评估其危险性具有重要的意义。首次利用整合酶简并引物 PCR扩增产物Int及I型整合酶IntI、II型整合酶IntIIPCR产物制备核酸探针，通过比较 确定利用菌落原位杂交检测整合酶来确定细菌中是否含有整合子的方法更便捷，该方法在国 内尚未见报道。并首次对含有整合子的多重耐药大肠杆菌进行了ERIc-PcR分子生物学基因 分型，在株水平上揭示了其流行病学情况。具体试验内容与结果如下： 1．从哈尔滨市的猪场和鸡场内共分离鉴定出(人源、猪源、鸡源)301株大肠杆菌。采 用Ir}10推荐的K-B法，测定分离菌株对常用的16种抗苗药的耐药性，药敏实验结果显示链 霉素、庆大霉素、磺胺甲恶唑和复方新诺明的耐药率较高。猪源和鸡源大肠杆菌未发现对磺 胺类药物敏感的菌株。同时耐3种以上抗菌药物的多重耐药菌株有247株，占总分离菌株数 的82％。氨基糖苷类药物中．对链霉素耐药的菌株．对庆大霉索、新霉素、卡那霉素的耐药 率都很高，其中，人源大肠杆菌交差耐药率为100％、猪源在80％以上、鸡源在74％以上。 三种来源大肠杆菌对磺胺类药物磺胺甲恶唑及复方新诺明的交叉耐药率在97％左右。 药菌特有，1991bp大小的整合子为猪源菌和鸡源耐药菌共有。1664bp大小的整合子为猪源 耐药菌、鸡源耐药菌和人源耐药苗共有。HinfI内切酶酶切图谱分析表明，扩增的各类相近 VII 东北农业大学农学博士学位论文 大小的整合子基因盒插入区片段。只有猪源耐药菌单带1009bp大小与猪源耐药菌双带中 1009bp大小片段所含基因盒不同，其余相近大小的整合予基因盒插入区所含基因盒都相同。 含有dfrl7、aadA5基因盒；1991bp整合子可变区含有dhfrXII、aadA2基因盒及orfF开放 阅读框7 合子所含基因盒的结构共有6种，包括10种各不相同的基因盒和2种功能不明的开放阅读 框． 4．利用地高辛标记制备了Int、Int l、IntII三种核酸探针，他们的显色敏感度为2pg， 三种探针不与金黄色葡萄球菌ATOe—sDNA、铜绿假单孢菌ATGc2，。DNA、及正常鼠肺组织 DNA显色，探针特异性较好。Southern杂交显示三种探针检测整合酶基因与PCR方法的符合 I、Int 率为100％。地高辛标记的Int、