奶牛γ-干扰素因的表达及其在乳房炎防治中的初步应用.pdf

许佥俊：奶牛Y一干扰素基因的表迭及其在乳房擞防治中的初步应用 奶牛y一干扰素基因的表达及其在乳房炎 防治中的初步应用 研究生：许金俊 导师：秦爱建教授 捅妾 Y．干扰素(口Ⅲ．Y)是在病毒等特定诱生剂的诱导下，由机体的T细胞和NK 细胞所分泌产生的一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能的细胞因子，一直是 现代医学和生物学领域研究的热点，利用基因工程技术生产的商品化重组Y．干扰 素已经成功应用于人类疾病的预防和控制。与人IFN．Y相比，动物IFN．Y的研究 普遍滞后，自Cctretti1986年首次报道牛IFN．Y(肋zFMY)基因后，国外学者 Y控制奶牛乳房炎进行了一些研究探讨，国内这方面的研究尚处于空白。为了开 拓利用rBo珏N．y控制奶牛乳房炎的新途径，克服传统的依靠药物和疫苗手段控制 乳房炎所存在的效果差、细菌耐药性增加、药物残留和免效失败等诸多方面的缺 陷，本研究在克隆出肋腰Ⅳ-J，基因的基础上．利用多种表达系统对日D巩Ⅳ-，，基因 进行了表达和表达产物活性比较分析，选择出具有较高生物学活性的rBoWN-Y， 并在奶牛乳房炎治疗中进行了小规模田间应用试验，旨在为临床上奶牛乳房炎的 防治提供新方法和新手段。 一、奶牛Y．干扰素基因成熟肽片段在大肠杆菌中的高效可溶性表达及 其特异性抗体的制备 根据已发表的奶牛BolFN-r基因的eDNA序列设计一对引物，应用一步法逆 转录一聚合酶链式反应(RT．PCR)技术从经PHA刺激诱导的奶牛脾脏淋巴细胞 RT．PCR产物克隆到pUCm-T载体，经过限制性酶切分析、测序证实扩增得到的 BolFN-’，基因序列完全正确。用限制性内切酶将该基因片段从pUCm-T载体切下 后按正确的阅读框架亚克隆入大肠杆菌表达载体pGEX-6P一1谷胱甘肚一s·转移酶 Ⅱ 扬州大学博士论文 小42 可溶性形式得到表达，经过薄层扫描测定可溶性融合蛋白表达量约占菌体可溶性 总蛋白的25％。通过VSV．MDBK细胞病变抑制试验证实，融合蛋白具有一定的 通过SDS电泳分离融合蛋白．切取含目的条带凝胶，液氮冻干碾碎后 作为免疫原腹腔免疫BALB／C小鼠，免疫4．5次后采集血清，经过间接ELISA试 验证实所制备的抗体特异性的针对GST-BolFN．Y融合蛋白，为下一步制各抗 rBolFN-Y特异性单抗和rBolFN．Y的表达鉴定提供了有力的保障。 二、抗重组奶牛Y．干扰素特异性单克隆抗体的研制及鉴定 蛋白条带作为抗原腹腔免疫BALB／C小鼠，取脾脏细胞与SP2／O细胞进行细胞融 波裂解物分别作为包被抗原，通过间接ELISA方法比较筛选到2株效价高、性质 肠杆菌的超声波裂解物反应的针对rBo玎刚．Y的特异性单克隆抗体，分别命名为 量为42kDa特异性蛋白质条带，与mT0诱导的表达GST的非重组菌不反应，进 7，细胞上清效价可达到l：25600，4G5单抗腹水 抗腹水的效价可以达到1：1．3×10 和细胞上清的效价均比4A3略低。应用捕获ELISA方法进行亚类鉴定结果表明单 对大肠杆菌表达的rBolFN．_r具有一定的中和作用。本研究所获得的两株单抗为下 一步利用pcDNA和杆状病毒真核表达系统表达rBolFN-T时表达产物的检测鉴定 和表达产物的亲和层析纯化提供了可靠的手段和保障。 三、奶牛Y．干扰素基因的克隆及其在COS．1细胞中的暂态表达 由于原核表达系统的诸多缺陷，为了开发真核表达的安全、高效、廉价的 rBolFN．y用于生产实践，同时鉴于许多基因在真核表达系统中表达产量极低或不 表达，我们对BolFN-r基因在COS-1细胞中进行了暂态表达试验。应用两步法 RT．PCR技术从经PHA刺激诱导的奶牛脾脏淋巴细胞的总RNA中扩增出含信号肽 许金俊：奶牛y一千扰素基因的表达及其在乳房炎防治中的初步应用 III 载体中，经过限制性酶切分析筛选正向插入的克隆并测序。将该基因片段从 I双酶切后克隆到真核表达载体 pMDl8一T载体中用HindⅢ和BamH 进行间接免疫荧光实验(Ⅱ1A)检测，结果表明，在COS．I细