布鲁氏菌外膜蛋omp15的原核表达及免疫活性鉴定.pdfVIP

摘要 布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患病，给畜牧业的发展和人类的健康 带来了很大危害。准确的诊断是有效控制和消灭布鲁氏菌病的前提，但目前常用的布 鲁氏菌病血清学诊断方法不能区分是疫苗免疫还是自然感染后引起的血清学反应。研 制具有标记性的疫苗或寻找合适的布鲁氏菌诊断性抗原一直是人们的目标，所以具有 免疫原性和抗原保护作用的布鲁氏菌外膜蛋白就成了研究的热点。本试验从GenBank 中下载编码布鲁氏菌外膜蛋白的基因，用BLAST分析后选取与布鲁氏菌猪、牛、羊 这三种生物型基因序列的同源性高又与其他革兰氏阴性细菌没有交叉反应的基因，同 时对目的基因编码的蛋白质用TMHMM和ConPredII软件进行信号肽和跨膜结构的分 析后，选取没有跨膜结构且全部在膜外的蛋白进行研究。本试验依据以上条件选取了 羊布鲁氏菌16M预测的分泌性蛋白质Ompl5对其进行初步研究。 本试验采用降落PCR方法，以灭活的羊布鲁氏菌16M的基因组为模板，扩增出 I、EcoR I双酶切后 大约423bp的基因片段，将目的基因片段用限制性内切酶BamH 直接与同样双酶切的表达载体pGEX．4T-2连接，将该片段克隆于原核表达载体 鉴定、重组质粒的双酶切鉴定和测序鉴定：证明成功扩增出了目的基因，并且将其成 mmol／L IPTG条件下诱导后5h目 功重组到了表达载体pGEX．4T-2中。重组菌在O．5 的蛋白质表达量达到了高峰。表达融合蛋白质分子量约为41kDa，以包涵体形式存在。 以不同浓度尿素洗涤包涵体，然后用8M尿素溶解，电洗脱方法纯化融合蛋白质。用 鼠的布鲁氏菌阳性血清发生较强烈反应。进而用电洗脱方法纯化了该蛋白质，并将其 作为抗原包被，用豚鼠的布鲁氏菌阳性血清为一抗，兔抗豚鼠IgG为二抗，进行ELISA 检测，进一步探索获得的蛋白质作为诊断蛋白的可能性。 诊断性抗原的可能性，但该结果为蛋白功能研究和布鲁氏菌诊断性蛋白的筛选奠定了 基础。 关键词：羊种布鲁氏菌；外膜蛋白；反应原性；原核表达；鉴定 ProkaryoticofBrucellaOuter Expression Proteinl5andIdentificationofIt’S Omp Immunocompetence Shaohua Author：Wang JiaxinDr．Wu Qingmin Supervisor：Prof．Wang Science Major：PreventVeterinary Abstract zoonotic wascaused issevere Brucellosisisa diseasethat brucella by spp．．It affectting humanshealthandthe ofanimal was developmenthusbandry．Accuratediagnosispremise foreffectivecontrolan