携带口蹄疫病毒fmdv）前导蛋白基因逆转录病毒载体的构建及其在牛肾细胞中的表达.pdfVIP

摘 要 disease 口蹄疫(Foot．and．mouthdisease，FMD)是由1：3蹄疫病毒(Foot．and—mouthvirus，FMDV) 引起的牛、羊、猪等偶蹄动物的一种急性接触性传染病，发病率很高，并能形成大范围流行，给 流行的国家和地区造成极大的政治、经济损失。随着分子生物学相关技术在口蹄疫病毒研究中的 应用，研究者对口蹄疫病毒基因组结构和功能有了不同程度的了解。其中，口蹄疫病毒的毒性蛋 白对于宿主细胞的毒性作用已经成为国内外研究的热点之一。 本研究以0型口蹄疫病毒为研究对象，克隆了O型FMDV OAl58毒株前导蛋白(L邮)编码 粒共转染于GP2。293包装细胞中，收集假病毒。通过电镜观察，发现直径约为60rim，外有囊膜， 衣壳呈六边形的病毒粒子存在。用假病毒感染牛肾细胞(bovinecell，MDBK)，嘌呤霉素抗 kidney 性筛选阳性细胞并且加入四环素抑制Lab基因的表达。通过12天嘌呤霉素的筛选，待抗性克隆形 成时，利用有限稀释法挑取单个抗性细胞克隆。将单个抗性克隆分别扩大培养后，经除去四环素 诱导整合于宿主细胞基因组中的Lab基因表达，挑选出能在较短时间内使MDBK细胞发生病变的 阳性细胞株进行传代培养。利用PCR手段，证实Lab基因被整合到MDBK细胞基因组中，并能 稳定地随宿主细胞传代；利用RT-PCR检测手段，证实Lab基因在无四环素的情况下能够被转录。 检测手段鉴定L即的表达。结果显示，目的蛋白与O型FMDV抗血清能特异性反应。这表明，目 的蛋白具有与。型FMDV感染宿主细胞后产生的L即相同的活性。 本试验利用可调控逆转录病毒载体介导基因转移技术，将。型FMDV的Lab基因整合于 MDBK细胞基因组中，成功建立了可稳定表达L即目的基因的转基因细胞株，为今后研究L咿或 其他毒性蛋白提供了新的思路。 · 关键词： El蹄疫病毒，前导蛋白，逆转录病毒载体，假病毒，抗性克隆，稳定表达 Abstract Foot-and—mouthdisease thecausativeofthe most virus(FMDV)is agent economicallyimportant animalviraldisease associatedwithFMDis disease world-wide．Althoughmortality usuallylow，the decreaseslivestock affectedcountriescannot in wadeof international productivity，and pattieipate animalsandanimal ofmolecular to products．Withapplications biologytechniqueFMDV,FMDV toxic havebeenreseachhot proteases point． virus OA／58 were as Foot-and—mouthdiseasestrain RNAsused forRT-PCR．The templates eDNA wereclo