家蚕第二白卵近基因系差异表达基因的研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 随着家蚕基因组与功能基因研究的逐步深入，家蚕转基因技术在作为鳞翅目模式 的基础科学研究和蚕丝产业领域的应用需求越来越迫切，家蚕转基因育种技术的研 究、开发利用已经成为蚕业科技界关注的焦点，而转基因阳性个体的高效检测技术是 建立家蚕高效转基因技术的核心之一。 家蚕第二白卵（w-2：10-16.1）性状个体的卵色和眼色均呈普通遗传，但目前人 们对第二白卵性状相关的分子机制尚缺乏了解。第二白卵对孵化、生命力、经济性状 等方面的影响都很小，卵及复眼与正常型十分容易区分，适于作为转基因个体筛选的 标记基因。为此，我们通过构建家蚕第二白卵近等基因系，尝试利用抑制消减杂交技 术（suppression subtractive hybridization ，SSH）探索卵色性状形成相关基因 的线索，为进一步阐明家蚕第二白卵性状形成的分子机制、开发新型转基因标记基因 技术提供参考。 本研究取得如下主要进展： 1. 家蚕第二白卵近等基因系构建 以限性黑卵品种苏卵伴为w-2基因供体，与常用的正常型黑卵品种菁松A杂交， 以菁松A为轮回亲本进行连续回交。累代选留经 w-2基因测交系验证的雄性杂合个体 （＋/ w-2）回交菁松A雌性个体（＋/＋）至BC6，全程实行蛾区育，BC6以后再经2 代以上同蛾区交配，获得纯合的第二白卵系统。由此最终建立正常型黑卵品种菁松 A （以下简称黑卵品系）及其第二白卵近等基因系（菁松A白，以下简称白卵品系）， 其理论纯合度达99％以上。 2. 家蚕第二白卵近等基因系转色卵抑制消减杂交及文库构建 为了获得正常型黑卵品系相较于第二白卵品系上调表达的基因信息，选择以正常 型黑卵（菁松）为试验组（tester）, 其第二白卵近等基因系为参照组（driver）进 行抑制消减杂交，建立了消减杂交文库。随机选择文库中65个克隆进行序列分析，共 获得65个、37种cDNA序列，长度为107bp－531bp之间。对家蚕基因组和EST数据库进行 同源性分析表明，其中30个基因序列为家蚕基因序列，7个序列未能在家蚕基因组发现 同源序列。 在30个家蚕序列中，9个cDNA序列在2个以上克隆中出现，出现频次占测序总克隆 数的49％，推测这些序列代表了转色卵期正常型黑卵与第二白卵之间表达量差异较大 的基因。 I 摘 要 3. H46序列cDNA3’末端快速扩增 经对家蚕EST数据库进行同源性分析和电子杂交延伸发现，文库中高频次出现克隆 H46序列在3’末端有2种以上拼接可能。以菁松A转色期蚕卵的总RNA反转录产物为模板 进行H46序列的3’cDNA末端扩增，利用DNAStar软件包中的EditSeq软件进行拼接，确 认了菁松A转色期蚕卵中该基因的3’末端结构。 4. 基因表达差异的半定量RT-PCR验证分析 选择在文库中2个以上克隆中出现的序列H46和H194作为代表，对黑卵系统和白卵 系统转色期蚕卵进行了半定量RT-PCR验证分析，初步判定H46和H194序列所代表的2个 基因在转色期黑卵品系中的表达量均明显高于白卵品系中的表达量。 5.第二白卵近等基因系间基因表达差异的定量分析 用荧光实时定量RT-PCR技术进行了黑卵品系与白卵品系转色期（卵龄6～36hr）蚕 卵H46和H194序列所代表的基因的表达水平比较。H46在黑卵品系转色期蚕卵中的表达 量为白卵品系转色期蚕卵的1833倍，差异非常显著。H194在黑卵品系转色期蚕卵中的 表达量为白卵品系转色期蚕卵的36倍，差异明显。 本实验建立并利用家蚕第二白卵近等基因系实验为消减杂交文库建立的材料，降 低了非目标性状间可能存在的差异造成的假阳性出现概率，在方法学上作了有益尝试。 本实验得到的消减文库cDNA序列信息为揭示转色卵在转录组水平出现的真实差异提供 了基础。 关键词 家蚕 第二白卵 抑制消减杂交 基因克隆 实时定量 RT-PCR II