柞蚕kazal丝氨酸蛋白酶抑制基因克隆及表达特征分析.pdfVIP

万方数据 摘 要 丝氨酸蛋白酶抑制剂 （serineproteinaseinhibitor，SPI）在生物体内能与丝氨酸蛋 白酶相互制约，调节丝氨酸和半胱氨酸酶的活性，调节丝氨酸蛋白酶活性，形成一定 的动态平衡，是一种调节剂，参与抗凝血、生殖、抑制过度自我吞噬、抗菌、免疫应 细胞分化、凋亡、组织重建及免疫等重要过程。丝氨酸蛋白酶抑制剂根据分子中的疏 水中心、形成二硫键的架桥结构、序列是否同源性相似和他们本身结构的紧凑性主要 分为Hinudim家族、Stefins家族、Cystatins家族、Cysteineproteinaseinhibitors家族 及Squashseedinhibitors家族等，为一类蛋白超家族。 本研究基于前期柞蚕cDNA文库获得的部分序列设计引物利用RACEPCR方法 克隆了柞蚕Kazal 型丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal-type .KSPI),ApKTSPI 基因的cDNA 序列并进行序列分析，柞蚕ApKTSPI 基因的cDNA全长568bp，含54bp5’非编码 区和223bp3’非编码区，开放阅读框为291bp编码96个氨基酸，含 18个氨基酸 MKATTLIIFAVLFVAVNC Kazal （ ）的信号肽和一个 结构域。和印度柞蚕亲缘关系最 近，其次亲缘关系比较近的是罗奴霉素毛虫（Lonomiaobliqua），而与半翅目、双翅 目及鳞翅目昆虫的亲缘关系较远。利用实时定量PCR检测到ApKTSPI 基因在柞蚕5 龄幼虫的脂肪体中特异性的高表达，其次是马氏管，而在表皮、血细胞、丝腺和中肠 中表达量相对较低。分别用柞蚕核型多角体病毒（nuclearpolyhedrosisvirus，NPV）、 细菌 （Escherichiacoli）和真菌 （Beauveriabassiana）3种不同的病原物免疫刺激柞蚕 5 PCR 5 ApKTSPI 龄幼虫，利用实时定量 检测到柞蚕 龄幼虫脂肪体中 基因在核型多 角体病毒 （NPV）、大肠杆菌 （E.coli）和白僵菌 （B.bassiana）免疫刺激后表达量都 能上调，但上调的程度和时间都不同。利用表达载体pET28a 构建了重组质粒 pET28a-ApKTSPI，转化大肠杆菌BL21后利用IPTG诱导表达，SDS结果表明 ApKTSPI 蛋白在大肠杆菌中成功诱导表达，并且IPTG浓度在0.2mM 时ApKTSPI 表达量最高。 本研究获得了柞蚕ApKTSPI 基因的cDNA全长，并研究了ApKTSPI 基因在组织 及病原物免疫刺激后表达模式，为进一步研究其在柞蚕免疫中的功能及作用机理奠定 了基础。 关键词：柞蚕,Kazal, 基因克隆, 表达特征 I 万方数据 Abstract Serine proteinase inhibitors are a superfamily of proteins, which control protease-mediated processes by inhibitingtheir cognate serineprotease. Serineproteinase inhibitors have been reported to involve in some biological procession, such as blood coagulation, fibrinolysis, inflammatory response, cell differentiation and apoptosis,tis