全新DNA分子测序技术的原理发展及应用.pptVIP

分子生物学讨论课 发展 及医学应用 DNA测序基础的原理 讨论组成员 王苗苗 岳莹莹 谭辽 吴兆平 吕琳 周雨馨 洛桑次珍 任怡君 * DNA测序技术的发展 及原理 DNA测序技术的发展 DNA双脱氧链末端终止测序 DNA化学降解测序 第一代测序技术 454焦磷酸测序 第二代测序技术 纳米孔单分子测序技术 第三代测序技术 * 在1977年，Sanger等提出了经典的双脱氧核苷酸末端终止测序法 此后，在S a n g e r 法的基础上，80年代中期出现了以荧光标记代替放射性同位素标记、以荧光信号接收器和计算机信号分析系统代替放射性自显影的自动测序仪 Sanger 区别 同一年（1977），Gilbert等提出了化学降解法。该方法与Sanger法类似，都是先得到随机长度的DNA链，再通过电泳方法读出序列。 Gilbert 二者的不同之处在于，Gilbert法是先用特定的化学试剂标记碱基再用化学方法打断待测序列，而Sanger法是通过ddNTP随机中断合成待测序列。 第一代测序技术 * 第一代测序技术 ●原理 2.化学修饰法测序 化学试剂处理末段DNA片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳分离。化学切割反应：包括碱基的修饰修饰的碱基从其糖环上转移出去在失去碱基的糖环处DNA断裂。 1. Sanger法测序 利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 * 第一代测序技术 在化学降解测序法中, 一个末端被放射性标记的DNA 片段在5组互相独立的化学反应中分别被部分降解,其中每一组反应特异地针对某种碱基。因此生成5组放射性标记的分子, 每组混合物中均含有长短不一的DNA 分子, 其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA 片段上的位置。最后, 各组混合物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离, 再通过放射自显影来检测末端标记的分子。化学降解法刚问世时, 准确性较好, 也容易为普通研究人员所掌握, 因此用得较多。而且化学降解较之链终止法具有一个明显的优点, 即所测序列来自原DNA 分子而不是酶促合成产生的拷贝, 排除了合成时造成的错误。但化学降解法操作过程较麻烦, 逐渐被简便快速的Sanger 法所代替。 * 第二代测序技术 第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等大量的测序工作，然而 它依然存在很多问题 经过不断的开发和测试，进入21世纪后，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二代测序技术诞生了。 成本高 速度慢 具有生物 学偏好 第二代测序技术的诞生 第一代测序 技术缺陷 * 焦测序技术 第二代测序技术 它在DNA 聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4 种酶的协同作用下 使引物延伸聚合脱氧核糖核酸（ dNTP）释放焦磷酸盐（PPi）、PPi转换三磷酸腺苷（ATP）、ATP 产生荧光信号与dNTP 和ATP 的降解等化学反应偶联起来 检测结果准确可靠。 * ●原理 焦测序技术是一种基于发光法测定焦磷酸盐（PPi）的测序技术［3］。其原理是：引物与模板DNA 退火后，在DNA 聚合酶（polymerase）、三磷酸腺苷硫酸化酶（ATP sulfurylase）、萤光素酶（ luciferase ）和三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）4 种酶的协同作用下完成循环测序反应。当加入的dNTP 与模板互补时，DNA 模板与互补的dNTP 聚合时可以产生等摩尔PPi，在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化下，PPi 与5-磷酸化硫酸腺苷（APS）反应生成等量的ATP；在萤光素酶催化作用下，ATP 与虫萤光素（luciferin）反应发光，最大波长约为560 nm，可用光电倍增管（PMT）或电荷耦合装置（CCD）检测。产生的荧光信号强度与聚合的dNTP 个数成正比，根据加入的dNTP 类型和荧光信号强度就可实时记录模板DNA 的核苷酸序列 第二代测序技术 * 第三代测