全新ff免疫学检测技术的基本原理.ppt

免疫学检测技术： 运用免疫学原理设计的检测方法 可用于： 诊断免疫相关性疾病 探讨发病机制 监测病情和治疗效果 第一节 抗原或抗体的检测 对感染性疾病的诊断： 感染早期：查病原体（抗原） 感染晚期：检测特异性抗体 一、抗原抗体反应的原理： （一）特异性：Ag（表位）与Ab(CDR)的结合 可逆性：非共价键结合 （二）可见性：Ab与Ag的比例合适 ? 形成肉眼可见聚合物。 阶段性：特异性结合阶段：几秒~几分钟 可见反应阶段： 几分钟~几小时~几十小时 影响抗原抗体反应的主要因素： Ag与Ab的浓度、 比例 抗原与抗体的种类： 抗原的类型： 颗粒性抗原：细胞，细菌，人工微球/珠 可溶性抗原：细胞成分，蛋白分子，小分子化合物 抗体的类型： 多克隆抗体(抗血清): 识别多个表位，特异性差 单克隆抗体：识别单个表位， 特异性好 抗-抗体（二抗）：抗异种Ig的抗体 二、抗原或抗体的检测方法 （一）凝集反应：（agglutination） 颗粒性抗原（或可溶性抗原吸附在与免疫无关的载体上）与相应抗体在适当条件下形成肉眼可见的凝集小块。 1、直接凝集反应： 天然颗粒性抗原（细菌或细胞）与相应抗体直接结合所出现的凝集现象 ： （1）玻片法—定性试验：已知 Ab ? 未知 Ag(?) ABO血型鉴定， 细菌种属抗原型别的鉴定 （二）沉淀反应 (precipitation) ： 可溶性性抗原与相应抗体直接结合，在适当条件下形成肉眼可见的沉淀现象（沉淀线）。 ３、免疫电泳 （immuno electrophoresis) （四）免疫标记技术 －用标记抗体或抗原进行抗原抗体反应： 1、免疫荧光技术 （immunofluorescence techniques） 1、免疫荧光技术 （immunofluorescence techniques） 2、免疫酶标技术： 用酶标记Ab(或Ag)与标本中的Ag(或Ab)发生特异性结合 加入酶的底物，在酶作用下产生有色物质 根据颜色可作出判断或测量光密度值 （1）双抗体夹心法： （2）间接法 3、放射免疫测定（radio immunoassay，RIA）： 利用放射性同位素标记技术检测抗原的技术 灵敏度高，用于检测激素等血清中微量物质 第二节 免疫细胞测定 一、淋巴细胞的分离与类型鉴定 外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞。 红细胞和多核白细胞密度：为1.092左右， 淋巴细胞和单核细胞密度：1.075～1.090， 血小板密度：1.030～1.035。 聚蔗糖－泛影葡胺(Ficoll):1.077±0.001 一、免疫细胞的分离： （一）外周血单个核细 胞（PBMC）的分离： 方法：密度梯度离心法 分离液：聚蔗糖泛影葡 胺 （比重：1.077 ±0.001） （二）T、B细胞的纯化： 贴壁法——去除单核细胞 花环沉降法、尼龙毛法——分离T、B细胞 （三）免疫磁珠分离法： （四）FACS分离法： 二、T细胞数量检测： 1、E花环试验： 原理：T细胞均有CD2分子，而B细胞无; 将SRBC与人外周血淋巴细胞混合; SRBC可结合于T细胞周围形成花环细胞。 2、免疫荧光标记技术： 用荧光素标记CD3、CD4或CD8单抗与淋巴细胞混合 经荧光显微镜观察 或用流式细胞仪测定 三、NK 细胞杀伤功能检测： -----NK细胞具有非特异杀伤肿瘤活性，在体外与肿瘤细胞混合，可被激活而杀伤肿瘤细胞 取外周血淋巴细胞（含NK细胞） 与K562（白血病细胞株）混合，孵育4h 通过形态学或细胞计数方法检测K562肿瘤细胞被杀伤的数量 计算NK细胞的杀伤活性 四、白细胞功能测定 （一）、T 细胞功能测定 １、Ｔ细胞增殖试验 　T细胞对特异和非特异性抗原的识别过程不同，但被激活后，诱发的分裂和增殖过程却是相同。 用T细胞敏感刺激物体外刺激T细胞， T细胞发生增殖、转化，根据增殖转化能力评价T细胞功能。 形态学特征: 体积增大4---5倍; 核染色体疏松; 核 仁明显; 胞浆出现空泡。 （１） 3H-TdR