鸡β-防御素-cdna的克隆及在毕赤酵母中的表达.pdfVIP

摘要 B．防御素属抗菌肽，因具有广谱抗微生物和免疫增强作用以及对病原微生物 不易产生抗性等优点而成为当前生物医学的研究热点之一。为探讨B．防御素在巴 斯德毕赤酵母系统中的高效表达，本研究以家禽B一防御素Gal．8为研究对象，运 用分子生物学技术，从安徽三黄鸡肝脏组织中克隆出Gal．8基因片段，并构建 pGEM．T 融合蛋白GST-Gal．8。具体内容和结果如下： 1．应用RNATrizol Reagent试剂盒抽提法，从安徽三黄鸡肝脏组织中提取了总 分光光度计检测OD260／OD280值为1．8，RNA纯度符合实验要求。 用随机引物逆转录合成eDNA第一链，运用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)， 从安徽三黄鸡肝脏组织中克隆出目的基因，对PCR产物进行纯化回收，构建 pGEM．T 变异，同源性达98．3％；分析Gal．8编码框分别由20个氨基酸残基的信号肽、5 个氨基酸的原片段、41个氨基酸的成熟肽组成。以pGEM．TEasy-Gal．8质粒为 模板，Pl／P3为引物PCR扩增出123bp碱基的Gal一8成熟肽基因片段。 3． 表达载体。对PCR鉴定的阳性转化子进行线性化与纯化，电转化入巴斯德毕赤 酵母，以1％甲醇进行诱导表达