最新PCR和DNA测序.ppt

常用的PCR技术 热启动PCR TD-PCR(touch down PCR,TD-PCR) 巢式PCR 反向PCR 锚定PCR 荧光定量PCR RT-PCR 不对称PCR 1、热启动PCR 方法： 退火之前，将DNA聚合酶与其他反应物隔绝 或者使用在高热状况下才会活化的聚合酶 2、TD-PCR 3、巢式PCR Nested PCR 两套PCR引物 （巢式引物） 两轮PCR扩增 4、反向PCR 普通PCR只能扩增两端序列已知的基因片段， 反向PCR则可扩增中间一段序列已知，而两端序列未知的基因片段 5、锚定PCR 锚地PCR技术是 用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。 6、RT-PCR 反转录RCR（reverse transcription PCR,RT-PCR） 实时荧光定量PCR（real time PCR,RT-PCR） 7、RACE技术 RACE：快速扩增cDNA末端(Rapid Amplification cDNA End)技术，获得全长cDNA的快速有效的方法。 RACE法就是通过向cDNA末端加尾，根据已知序列和加尾 设计引物扩增 获取cDNA末端未知序列的方法。 5‘ RACE 和 3RACE的原理不一样 Takara公司3 RACE和 5 RACE 试剂盒原理 3’RACE的局限性及注意事项 3’末端RACE相对容易，因为存在一个poly(A)，而且降解常不是从3末端开始的。 局限性： 细菌和一些病毒的基因组的3’末端通常没有poly（A），这个方法就不适用； 而且在有一些RNA中，这个poly(A)也容易丢失 解决办法：可以通过poly(A)聚合酶在末端加A即可 RNA中加入RNA酶抑制剂，很有利于保持完整的RNA 5’RACE的局限性 通常，提取的RNA都会有些降解，而RNA的降解是从5’端开始的，所以用5’末端磷酸化的RT-primer去拉的时候，5’末端往往不全，而且随着RNA链的增长，比如几Kb以上的，就更不能保证该引物能将5’末端拉全。 Takara公司的5’RACE新方法 8、实时荧光定量 PCR（real-time quantitative PCR） 普通PCR技术的定性和定量分析： 定性：凝胶电泳的方法 定量：通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描进行分析 对象：PCR扩增的终产物 Real-time Q-PCR 简言之，利用荧光信号检测整个PCR扩增过程，获得在线描述PCR过程的动力学曲线 RT-Q PCR 的应用 mRNA表达的研究，DNA拷贝数的检测，单核苷酸多态性（SNPs）的测定，病原体的检测，肿瘤诊断，基因突变、多态性及表达的研究，遗传疾病的诊断 RT-Q PCR 存在的问题 在标准曲线定量中，各实验室需要一个统一的标准品； 实验成本较高，荧光素种类以及检测光源的局限性，限制了它的应用能力； 研究mRNA时，受到不同RNA样本存在不同的逆转录（RT）效率的限制； 相对定量的前提：假设内源控制物不受实验条件的影响，内源控制物的选择也是实验结果可靠与否的关键； 不能监测扩增产物的大小（运用封闭检测技术）； DNA测序技术的诞生和发展 1980年， Sanger和Gilbert 因建立DNA测序技术而获得诺贝尔化学奖（Sanger是第2次获得诺贝尔化学奖 ） Sanger法：简便、快速，经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。 第二代测序技术（Next-generation sequencing)：费用更低、通量更高、速度更快。 第二代DNA测序技术 现有的技术平台主要包括：Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer 和 Applied Biosystems SOLID system。 三个技术平台各自的优点： 454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到400bp； Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10； SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，目前第二代测序技术中准确度最高。 DNA测序技术经历了漫长而曲折的发展历程。迄今为止，获得的绝大部分DNA序列都是基于Sanger测序法获得的 测序峰图 单分子DNA测序仪 美国Helicos BioSciences公司研究人员近日称，他们开发出了一种新型的测序设备——单分子DNA测序仪（single-molecule DNA sequencers）。该仪器