最新PEI介导的siRNA对肝癌细胞中ODC酶基因沉默.pptVIP

组长：马宗英 组员：盛 冰 马丽娜 舒 心 马金梅 马雪梅 马 楠 木娜瓦尔 contents contents 1 2 3 4 5 研究背景 研究目的 研究方案 结果预测和展望 可行性分析 1、研究背景 背景 ODC酶 RNA干扰 多胺 PEI 2、研究目的 通过基因沉默技术筛选出ODC酶表达抑制效果最好且副作用最小的siRNA分子，并试图上升到个体水平，为肝癌的研究提供一定的依据。 3、研究方案 材料 3.1 实验方法 3.2 检测方法 3.3 个体水平研究 3.4 SMMC7721肝癌细胞 细胞株 主要试剂 DMEM-F12、小牛血清、逆转录试剂盒、PEI、 SYBR Green RT-PCR 试剂盒、噻唑蓝（MTT）、 二甲基亚砜（DMSO）和Trizol 、DNA Marker 、 PCR引物 3.1 材料 siRNA的设计与合成 ①正义链： 5’GATCCCCTGAAGAGTTTGACTGCCACTAGAGGGTGGCAGTCAAACTCTTCATTTTTGAA-3’ 反义链： 5’AGCTTTCAAAAATGAAGAGTTTGACTGCCACGCTCTAGTGCAGTCAAACTCTTCAGGG-3’ ②正义链： 5’GATCCCCGACTGAAATACAGTTGGTGTAGAGCCACCAACTGTATTTCAGTCTTTTTGAA-3’ 反义链： 5’-AGCTTTCAAAAAGACTGAAATACAGTTGGTGGCTCTACACCAACTGTATTTCAGTCGGG-3’ ③正义链： 5’-GATCCCCTTGCATACTCTATGACCACTAGAGCGTGGTCATAGAGTATGCAATTTTTGAAA-3’ 反义链： 5’-AGCTTTCAAAAATTGCATACTCTATGACCACGATCTAGTGGTCATTAGAGTATGCAAGGG-3’ 3.2 实验方法 3.3.1 SMMC7721细胞培养 将冻存的SMMC7721细胞 37℃水浴 加入含牛血清、双抗溶液的DMEM培养基 37℃细胞培养箱中培养 ，用0.25%胰酶消化传代，取对数生长期的细胞进行实验。 3.3.2 载体的构建 构建了携带ODC siRNA①、②、③ 的序列的载体PEI-siRNA。 3.3.3 细胞转染 ODC siRNA 4μg 无双抗无血清培养基至250 μL 混匀，静置5min 另加PEI 10 μL和无双抗无血清培养基至250 μL 混匀，轻轻混合上述两种溶液，室温放置20 min 备用。 将3.3.1中对数期的细胞弃去原培养基 用2 mL 无血清的培养基孵育细胞2 h，弃去培养液加入上述溶液 将培养板置于细胞培养箱内孵育5 h 后去除转染混合液，更换为普通全培基 实验分五组： 1、SMMC7721组，即未转染细胞组 2、PEI 组，即转染空PEI载体细胞组 3、siRNAⅠ组， 即转染①序列siRNA 的PEI-siRNA细胞组 4、siRNA Ⅱ组，即转染②序列siRNA 的PEI-siRNA细胞组 5、siRNA Ⅲ组，即转染③序列siRNA 的PEI-siRNA细胞组 3.3 检测方法 Real-time PCR ODC mRNA 表达 Western blot ODC 蛋白表达 MTT比色法 细胞增殖能力 流式细胞术 细胞周期和凋亡情况 统计学分析方法 各组细胞ODCmRNA和蛋白表达水平是否有显著差异 1.3、RNA干扰 起始阶段 效应阶段 高特异性、高效性、可同时抑制多个基因 3.4 个体水平研究 材料 封闭群的雄性大白鼠若干只、轓水溶液（二乙基亚硝胺 DEN） RT-PCR、WestemBlot、MTT和流式细胞仪 实验内容 1、原发性肝癌大白鼠的模型创建 2、取上述模型大白鼠，等量分为四组，分别瘤内注射siRNA-PEI、生理盐水、空PEI以及传统的药物 3、测量肿瘤体积（七天为一个周期，超声检查）以及鼠的体重 4、最后一次给药2天后，颈椎脱臼处死大白鼠，取肿瘤组织，使用Real-time PCR、WestemBlot等方法进行相关指标的测量 contents contents 1 2 3 4 5 研究背景 研究目的 研究方案 结果预测和展望 可行性分析 4、可行性分析 可行性 介导载体：PEI 实验方法 siRNA技术 单一抑制敏感位点分别沉默 5、结果预测 一、体外水平 在SMMC7721组