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谢 谢 ！ * * * AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC GGAACGGTGTTCAGGACTCTGAA DNA甲基化及程度分析 用HRM方法检测MGMT启动子区域内的甲基化，可检测低达0.1%的甲基化程度；根据已知甲基化程度的标准曲线可对未知样品的甲基化百分比进行测定。HRM是一种高灵敏度的甲基化检测方法，并且其高度的重复性和低成本将对肿瘤的研究和临床应用有很大帮助。 MGMT：甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶是肿瘤细胞产生亚硝脲药物抗药性的分子基础，启动子区过甲基化而导致MGMT基因的转录失活，影响MGMT蛋白表达 标准曲线分析 融解曲线分析 绝对定量和相对定量解析方法 Real Time PCR 解析方法 提取样品 绝对定量解析方法 引物设计 标准品制备 Real Time PCR反应 数据分析 流 程 绝对定量解析方法 通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度。通常应用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。 105 104 103 101 扩增曲线图 标准曲线图 检测样品 检测样品 102 以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正， 进行相对表达量分析。 理论上目的基因表达量分析条件 Sample B Sample A 目的基因扩增效率相同 RNA提取效率相同 细胞起始数相同 进行相对表达量分析必要性 实际上目的基因表达量分析 管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ） 、Actin等。 筛选方法 根据文献提供 通过具体实验筛选 管家基因筛选 0 1 2 3 4 5 6 Sample1 Sample2 Sample3 Sample4 实验组 实验值 β-Actin GAPDH β-2-microglobulin HPRT 实验例 P P P O 管家基因筛选 HPRT：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶 检测样品 目的基因 管家基因 RNA样品1 X H RNA样品2 RNA样品3 用实验例对相对定量计算进行说明 相对定量解析顺序 目的基因X 管家基因H 已知量 Ct 定量结果 已知量 Ct 定量结果 标准品1 1 35.66 1 37.46 - 标准品2 10 32.77 10 33.06 - 标准品3 100 29.20 100 29.69 - 标准品4 1000 25.75 1000 26.10 - 标准品5 10000 22.06 10000 22.51 - 标准品6 100000 18.62 100000 18.88 - Sample1 - 27.22 343.3 - 23.17 6391.5 Sample2 - 31.70 17.3 - 22.70 8589.7 Sample3 - 24.62 1946.1 - 22.93 7432.9 相对定量解析顺序 通过标准曲线对对照样品、检测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。 相对表达量计算 相对值= 校正值= 目的基因定量结果 管家基因定量结果 检测样品的校正值 对照样品的校正值 相对定量解析顺序 检测样品 管家基因H 目的基因X 定量结果 定量结果 校正值 相对量 RNA样品1 6391.5 343.4 0.0537 1.000 RNA样品2 8589.7 17.3 0.0020 0.037 RNA样品3 7432.9 1946.1 0.2618 4.874 Real Time PCR 基础知识 Real Time PCR 实验方法 Real Time PCR 解析方法 Real Time PCR 应用实例 主要内容 Real Time PCR 应用实例 定性分析 对人的ALDH2基因进行SNP解析。 绝对定量 对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量分析。 相对定量 分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化。 定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析 检测方法 Cycling Probe法 SNP 位点 ALDH2 type1和ALDH2 type2 (G/A) 使用试剂 Cycleave PCR Core Kit TaKaRa Code.CY501 使用仪器 Smart Cycler Ⅱ 实验背景 Aldehyde dehydrogenase-2（ALDH2，乙醛脱氢酶）基因位于人类第12对染色体q24位置，有ALDH2 type1和ALDH2 typ