三江源国家自然护区土壤微生物的分子多样性研究.pdf

摘 要 土壤微生物是自然物质循环不可缺少的成员，担负着分解动植物残体的重要作 用，直接关系到土壤养分的有效性，对植物生长起到重要的作用，同时微生物在土壤 肥力评价和生物净化等方面也有着重要的作用。土壤微生物对环境变化很敏感，能够 较早地指示生态系统功能的变化，对于退化生态系统的恢复和治理以及提高不同植被 的生产力均有重要的理论和实践意义。 三江源自然保护区是青藏高原的主体部分，是黄河、长江和澜沧江的发源地，平 均海拔4400m，孕育了世界上海拔最高、面积最大的高寒草匈和高原湿地。该地区原 始自然状态保存较好，是气候、环境变化信息最敏感最完整的载体和自然环境演变过 程最忠实的科学记录。由于全球气候变化和人为破坏，“三江源”的生态环境不断恶 化，加强三江源地区的生态保护刻不容缓。研究三江源地区的土壤微生物，揭示三江 源土壤微生物的生态分布和区域特异性，将为评价三江源地区的生态环境，了解三江 源地区土壤微生物在全球变化中的影响，为三江源自然保护区保护策略的制定提供科 学依据。 本研究主要通过PCR扩增、基因克隆、RFLP和序列分析对三江源自然保护区不 同植被和海拔高度土壤环境中的固氮酶基因”口汀、反硝化酶基因n『，丘与nosZ和16s rDNA的分子多样性进行了分析，同时探讨了不同植被和海拔高度土壤中固氮微生 物、反硝化细菌等功能微生物的多样性及其主要影响因子。其主要结果如下： l、用于分子生态学研究的土壤微生物DNA提取方法研究 土壤微生物分子生态学研究的关键技术之一是从各种环境样品中高效的获得可 进行分子生物学研究的基因组DNA。本研究利用SDS高盐法、变性剂加SDS高盐法 和溶菌酶加SDS法三种方案对土壤微生物总DNA进行了提取，然后通过电泳加树脂 柱回收和连续2次树脂柱回收两种方法进行了纯化，结果表明，变性剂加SDS高盐 法的DNA提取效率明显高于其它两种方法，电泳加树脂柱法的纯化效果更好。PCR 刀口阿等功能基因的扩增。因此，认为变性剂加SDS离盐法是一种更为高效、可靠和 适合于环境微生物分子生态学研究的DNA提取方法。 2、三江源地区土壤固氮微生物的分子多样性研究 为了了解青藏高原地区土壤固氮微生物的群落结构及其差异，本研究首次利用 PCR-RFLP和测序分析对位于青藏高原腹地的三江源自然保护区土壤微生物固氮基 因(n／fH)的多样性和系统发育进行了探讨。研究选取了来自于不同海拔高度、植被 类型的6个样品，根据样地的生物地理化学性状的主成分分析(PCA)表明，6个样品 有l一2个明显的优势种群，并且得到了3个共同的RFLP谱带型，样地间的两两比较 近的样地阊具有更多的重叠数。RFLP和生物地理化学性状的主成份分析表明，土壤 中的C、N含量和C／N比是影响土壤中固氦微生物群落的重要因素，人为干扰和过渡 放牧也对固氮微生物有明显的影响。随着样地海拔的升高，各样地的克隆数和RFLP 谱带型数随着减少，相同植被类型样地中所得克隆数和RFLP谱带型数基本一致。 最后，选取59个克隆进行基因测序分析，通过DNAMAN软件分析表明，这些 序列问具有64％一98％的相似性。系统发育树分析表明，这些序列可以被分为4个不 3、三江源地区高寒草甸土反硝化细菌的分子多样性研究 高寒草甸是青藏高原的主要植被类型，也是我国特有植被。本研究通过应用 PCR-RFLP和测序分析对青藏高原腹地三江源自然保护区高寒草甸土壤反硝化细菌 基因(nirK和nosZ)的多样性和系统发育进行了分析，探讨了该地区反硝化细菌的 群落结构和影响因素。研究选用了4个海拔在4600m以上的高寒草甸样地，主成份 具有不同的明显优势种群，而对于nosZ基因，除样地YS一1有1个明显的优势种群外， 样地的RFLP谱带型数基本上与生物地理化学性状相～致，而nosZ则没有明显的一 致性。不同的环境因子影响分析表明，海拔高度和土壤C，N比可能是影响土壤反硝 化细菌的重要因素。 析表明，这些序列都可以分为4个不同的簇，分别与不同种属的细菌序列(例如 Blastobacter denitrificans．Nitrosoraonas irakensei等)具有较商的相似性，表明样地中多种细菌含有反硝 melilot、Azospirillum 化基因，是潜在的反硝化细菌。但是，各个样地间的反硝化序列没有明显的分布差异。 4、植被变化对三江源地区土壤微生物数量和多样性的影晌 本部分研究应