中国近海典型赤生物种间及生理指示生物标志物研究.pdfVIP

摘 要 东海原甲藻(ProrocentrumdonghaienseLu)和链状亚历山大藻 (Alexandrium Catenella)是我国近海两种主要有害赤潮生物，在东南沿海常 形成大规模的赤潮，已对近海生态系统、沿海养殖业、人民健康和生命财产安全 构成了严重威胁。 本论文以这两种赤潮生物为模式种，引入现代蛋白质组学概念及技术，比较 了四种蛋白质提取方法，建立了用于赤潮生物蛋白质组学研究的总蛋白质提取方 法：研究了两种亚历山大藻蛋白质组的差异，确认了种间特异性指示蛋白；比较 研究了不同生长期和生长条件下，赤潮生物蛋白质组的差异表达，确认、鉴定了 ～批特异性生理指示生物标志物，探讨了它们在赤潮生物生命活动及赤潮形成中 的作用。取得的主要结果如下： 1．建立和优化了用于赤潮生物蛋白质组学研究的总蛋白提取方法。比较研究了 四种蛋白质提取方法：曲拉通100-尿素提取法、三氯乙酸一丙酮沉淀法、 拉通100-尿素提取法的蛋白提取效果最好，蛋白点分离清晰，蛋白点数多(可 达上千点)，而且未造成碱性蛋白和高分子量蛋白的丢失。该方法提取过程 简单，操作简便，为开展赤潮藻生物蛋白质组学研究提供了一种高效、简便 的方法； 2．结合形态分类学和分子生物学方法，比较研究了我国近海两种主要赤潮生物 DH01 塔玛亚历山大藻A．tamarenseDlt01和链状亚历山大藻A．catenel]a 蛋白质组的差异表达，发现它们的蛋白2-DE图谱相似性达99％，在分类上， 这两种亚历山大藻应属于同一种藻。同时也发现了一些特异性表达蛋白，如 彳．tamatense DH01中的AT卜5，彳．catenellaDH01中的hCl-3，它们可作 为种内鉴定的一类特异性生物标志物； 3．比较研究了不同生长时期东海原甲藻和链状亚历山大藻蛋白质组的差异表 达，发现了一些与细胞生长周期相关的生物标志物：在东海原甲藻中发现了 一个与细胞周期调控相关的cdc2蛋白激酶1，该蛋白在指数生长期的藻细胞 中表达明显，在消亡期表达量明显下降，一些蛋白，如17-19号(RubisCo)， 21、23—26、28、30号，在消亡期几乎不表达；在链状亚历山大藻种也发现 了多个蛋白，3卜35，46—48、61-70号蛋白在消亡期表达量明显下降。这些 蛋白可作为指示细胞不同生长期的一类潜在的特异性生物标志物； 4．比较不同营养状态下的细胞蛋白质组的差异表达发现，在氮或磷限制的条件 下，东海原甲藻细胞中的一些蛋白，如PCI、PC3、PC5和PC7—9不表达，而 一组酸性蛋白，PC2表达明显增加，这些蛋白可作为指示氮或磷限制的生物 标志物；而一些蛋白仅在氮限制时表达明显减弱(PC4、PC6)或不表达(PPl-3)， 这些蛋白可作为指示氮限制的生物标志物：在链状亚历山大藻中也发现了一 个与氮限制相关的蛋白ANl：一些蛋白，如ANl—5、APl和ACl在添加氮或磷 后表达明显增强，并在藻细胞处于良好生长状态时也有很强的表达，这些蛋 白可作为指示藻细胞处于良好营养状态的生物标志物； 5．在环境胁迫条件下的东海原甲藻中发现了一些特异性蛋白，如对光胁迫产生 响应的热休克蛋白l-ISP78(10号蛋白)，对低温胁迫产生响应的蛋白，如13 和14号蛋白。在链状亚历山大藻中也发现两组蛋白，36—45和49—51号蛋白 在连续光照条件下表达特别明显，而在连续光暗和氮限制条件下都不表达， 且在正常生长条件、磷限制和低温处理条件下虽有表达，但含量较低。这些 蛋白可作为指示藻细胞处于胁迫状态的潜在的一类生物标志物。 关键词： 赤潮生物；生物标志物；蛋白质组；双向电泳；生物质谱 II Abstract Prorocentrmn LuandAiexandrimncatenellaaretwo harmful donghaiense key