亚洲玉米螟整合在血细胞包囊外源物过程中的功能研究.pdfVIP

摘要 摘 要 包囊反应是昆虫清除体内大量病原微生物和大的生物外源物如寄生虫、寄生蜂卵等的有 效手段，它需要昆虫血细胞尤其是粒细胞和浆细胞的参与，而浆细胞形态的改变是形成包囊 的必要条件。整合素(integrin)是一类普遍存在于细胞表面的跨膜糖蛋白，是连接细胞外基 质和细胞内环境信号转导的纽带。在昆虫中整合素对果蝇的生长发育及一些鳞翅目昆虫的先 eDNA(命名为何nt131)全长序列的基础上，以亚洲玉米螟幼虫为试虫，初步分析了OJint131 的组织分布及其在调控浆细胞形态变化及血细胞包囊外源物过程中的作用。 为在蛋白水平上对Ofintp1进行检测，克隆了胞外域靠近5’端一个408 bp的eDNA片段 (姐撑174．309)，其中包含一个配体结合位点(a硝173．177)。将Oyint131片段连接到表达载体 kDa的可溶性融合蛋白， SDS．PAGE检测表明锄mp1在大肠杆菌中可表达分子量约为27．6 Western blot分析表明表达产物能与抗6His单抗特异性结合，即表达的OflNTpl为C端带有6His 标签的融合蛋白。将经Ni-NTA亲和柱纯化的OflNTpl融合蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔， 800以上。Western印迹 制备了抗OflNT131的兔血清(命名为Anti．研INT131)，ELISA效价达12 检测结果表明，制备的抗血清可以特异识别表达的融合蛋l刍OflNTl31。 为检测C班nt131的组织表达差异性，提取了亚洲玉米螟5龄中期幼虫的血细胞、脑、表皮、 脂肪体、中肠、马氏管、气管7个组织的总RNA，利用RT-PCR进行了转录水平上的检测，结 果只在血细胞中检测到OfintB1的特异性表达带。而在其它组织中未检测到该基因转录本的存 在。不同组织的Westernblot分析表明，诱导和未诱导的血细胞蛋白粗提液中均有OflNT131表 n-]以与血细胞特异性结合。 131 达。血细胞免疫荧光定位实验结果也表明，Anti．OflNT B1兔血清封闭细胞表面表达的Q7crNTp1蛋白，结果表明血细胞 用不同稀释倍数的抗OflNT min后，2倍稀释的抗血清封闭的血 对载玻片的粘附能力因抗血清浓度的不同而不同。粘附30 细胞有明显的聚集，很难观察到血细胞粘附能力的变化；5倍与10倍稀释的抗血清封闭的浆细 胞对载玻片的粘附能力受到明显抑制：而100倍稀释的抗血清对浆细胞的黏附能力无明显抑制 saline处理的结果基本相同。说明OflNTp1在调控 作用，血细胞的状态与对照血清及Pringle’s 浆细胞形态变化和血细胞粘附过程中起了关键作用。 B1在血细胞包囊外源物过程中的功能，使用了RNA干扰的方法。首 为进一步分析Ofint 15(DE3)中诱导表达dsRNA，以期 先，构建了重组载体L4440．OfintB1，在大肠杆菌HTl 131的功能，但没有获得明显的干扰效果。之后， 通过饲喂细菌表达的dsRNA来研究Ofint 在体外人工合成dsRNA，注射到幼虫体内进行RNAi。结果表明在4龄末期注射dsRNA的处 131 理中，经过一次蜕皮后可检测到血细胞对外源物的包囊作用被明显抑制，初步证明Ofint 在包囊反应过程中起关键作用。 关键词：亚洲玉米螟；血细胞；粘附；包囊反应；整合素：RNA干