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浙江工商大学硕士论文 以枯草芽孢杆菌递呈对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28对 凡纳对虾抗病毒免疫保护机制的研究 摘要 对虾白斑综合征病毒(White Virus，WSSV)传染 SpotSyndrome 性强、宿主范围广、致死率高，是我国及世界对虾养殖业发生爆发性 流行病的主要病原，严重制约着对虾养殖业的健康发展。本课题组前 期实验成功构建了表达WSSV囊膜蛋白．VP28的重组工程菌 (B．subtilis．VP28)，并研究发现了该菌株能显著提高攻毒后的中国对 虾和螯虾存活率并且能特异性保护机体抗WSSV感染，但此免疫保 护机制还不甚清楚。本课题在此基础上，通过口服重组菌株 WSSV感染的保护效果及免疫功能的影响，并克隆分析与对虾适应性 免疫相关的免疫球蛋白超家族分子Dscam可变区序列，从Dscarn识 别与细胞吞噬途径探讨重组菌B．subtilis．VP28诱导对虾特异性抗病毒 感染的分子机制。主要研究内容和结果如下： 1．重组菌株B．subtilis．VP28对凡纳对虾体液免疫因子的影响 以芽孢重组菌B．subtilis．VP28作为免疫原口服免疫凡纳对虾，并 以B．subtilis和正常健康对虾作为对照，进行攻毒实验，并取对虾血 清检测抗菌活力、溶菌活力、酚氧化酶活力、超氧化物歧化酶(SOD) 浙江工商大学硕士论文 活性、酸性磷酸酶(ACP)活性和碱性磷酸酶(AKP)活性，另外取 对虾血细胞抽提总RNA，采用荧光定量PCR方法检测Toll样受体、 溶菌酶、血蓝蛋白和Dscam基因的mRNA相对表达量。实验结果表 明，B．subtilis．VP28能显著提高凡纳对虾血清各免疫因子的活性，说 明B．subtilis．VP28对凡纳对虾机体的体液免疫功能具有显著的增强作 导凡纳对虾机体启动免疫应答反应并释放免疫因子。 2．重组菌株B．subtilis．VP28对凡纳对虾血淋巴细胞特异性吞噬的影响 将重组菌株B．subtilis．VP28的芽孢形式和海藻多糖口服投喂免 疫凡纳对虾28d，并以B．subtilis和正常健康组作对照，分别在免疫 4d、7d、14d、28d后，检测不同试验组凡纳对虾血细胞吞噬活性。 另外分别在免疫4d、14d、28d后，差异分析各试验组血细胞对不同 抗原(WSSV和弧菌)的吞噬功能。实验结果表明，在免疫不同时间 内，B．subtilis．VP28均能显著提高凡纳对虾血细胞吞噬WSSV功能， 从而诱导机体产生细胞免疫。此外，在不同免疫时间内， 噬能力相比)；而B．subtilis组和海藻多糖组的对虾血细胞对吞噬 发凡纳对虾血细胞特异性吞噬作用介导机体的特异性抗病毒感染。 3．凡纳对虾Dscam选择性剪接外显子位点鉴别及可变区序列分析 Il 浙江工商大学硕士论文 分别以该基因的免疫球蛋白区和粘连蛋白区序列设计特异性引物，经 过PCR扩增、克隆及测序后，由多重序列比对得知：LvDscam存在 通过RNA选择性剪接机制产生3个192一N区变构体、4个193．N区变 构体和2个197区变构体，说明LvDscam具有分子多样性。另外，由 系统发育树分析可知：LvDscam在系统发育树的无脊椎动物分枝上占 据一个单独的进化亚单位分枝，预示着LvDscam可能是一种新型的 无脊椎动物Dscam蛋白。 4．差异分析不同免疫原刺激凡纳对虾Dscam特异性变构体库的特征 异性引物，克隆LvDscam可变区片段，并随机选取15个克隆子送至 择性剪接变构体，由此可说明LvDscam具有丰富的分子多样性。通 过组间LvDscam变构体多重序列比对，LvDscam能形成免疫原特异 新型192一N变构体模式和一个新型193-N变构体模式，推测 III 浙江工商大学硕士论文 发机体的特异性抗WSSV感染。 体液免疫因子；免疫基因；细胞吞噬；选择性剪接；免疫球蛋白超家 族分子(Dscam)；变构体库