双孢蘑菇多酚氧酶的研究.pdf

删Ir f I II IIII I IIIII III Y1 74691 3 摘要 摘 要 双孢蘑菇营养丰富，味道鲜美。然而，双孢蘑菇在贮藏和加工过程中极容 易发生褐变反应，严重地影响了产品的外观、风味、营养和加工性能，大大降 oxidase，PPO)是引起酶促褐变的主 低了商业价值，而多酚氧化酶(Polyphenol 要酶类。另外，近年来研究发现PPO能催化蛋白发生交联反应，从而可改善蛋 白质的功能特性。因此，双孢蘑菇多酚氧化酶值得深入研究。 本论文开展的研究工作主要包括双孢蘑菇PPO的分离纯化及酶学性质的研 究、双孢蘑菇PPO对乳蛋白交联的影响、双孢蘑菇PPO新基因的克隆、PP03 和PP04成熟酶基因的克隆及其在原核系统中的表达，研究的主要方法、结果及 结论如下： Fast Flow离子交换层析和Phenyl l采用硫酸铵分级沉淀、DEAE．Sepharose sepharose kDa，N端测序得到的氨基酸序列为： 测，该PPO分子量为43 Ala-Thr-Asn—Ser-Gly—Thr—Leu—lie—Ile·Phe。 2 oC和6．5．7．0。PPO对热不稳定，当 PPO活力的最适温度和pH分别为20 温度达到60 和Zn2+对PPO活力表现很强的抑制作用。以邻苯二酚为底物时，PPO的Km和 U／mLmin-‘。 mmol／L和3,333 Vm舣值分别为O．67 7、 3采用双孢蘑菇PPO对酪蛋白交联的最佳条件是PPO活力600 U／mL、pH 30℃反应6h，乳清蛋白交联的最佳条件是PPO活力600 3—5、40℃ U／mL、pH 反应4h。交联后乳蛋白的乳化性及其稳定性和起泡性及其稳定性发生了较大的 变化。另外，交联后B．酪蛋白、a．乳白蛋白和p．乳球蛋白的抗原性明显降低。 4通过多序列比对寻找真菌中PPO保守区的氨基酸序列，设计一对简并引 物扩增保守区的基因序列，克隆获得了两个新的基因片段，然后通过RACE技 1,844 bp，开放阅读框为1,731bp，编码576个氨基酸。PP04长度为2,042bp， 开放阅读框为1,836 摘要 5通过生物信息软件和网络服务器对PP03和PP04的氨基酸序列、系统进 化树、二级结构和三级结构进行分析，结果表明PP03和PP04确为编码双孢蘑 菇PPO的新基因。 6通过PP03和PP04 C．端切割位点的分析可知，PP03成熟酶基因含有 l，173 kDa；PP04成熟酶含有l，134 bp，编码391